视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右,雄鼠与雌鼠合笼交配;分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southernblotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠,荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果共注射41只雄性小鼠,存活34只,其中32只具有交配、受精能力,获得仔鼠382只。仔鼠经检测,PCR阳性133只,Southernblotting阳性15只。小鼠的年龄、注射剂量与EGFP的整合率没有明显关系,荧光显微镜观察下没有观察到组织冰冻切片中EGFP明显表达。结论曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞移植对海仁藻酸致SD大鼠小脑变性损害的实验研究

目的通过观察绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠神经干细胞(NSCs)移植对海仁藻酸(KA)致SD大鼠小脑变性损害区的存活、迁移情况,为临床上NSCs移植治疗小脑变性提供理论依据。方法SD大鼠40只随机分为正常对照组(A组),KA损伤未移植组(B组),KA损伤后注射生理盐水组(C组),KA损伤后NSCs移植组(D组)。分离、培养GFP转基因小鼠的NSCs,以立体定向微量注射方法移植至KA致小脑变性损害区,进行行为学、免疫组化研究。结果(1)行为学观察:A组大鼠头部及口鼻呈机敏的探索状,四肢及躯干动作协调,尾巴稍抬高,可左右摆动。B组和C组表现为精神差,厌食,少动,行动摇晃迟缓,身体左右摇晃,头部触地,尾巴拖地,多次侧翻跌倒并自己不能翻正,嘴部寻找食物笨拙,过竿时间较A组明显延长。D组行为学表现及过竿时间较A组差,但优于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫组化发现NSCs在小脑变性区存活和迁移,未见细胞过度增生。植入细胞存活数随时间延长而减少,7 d、14 d、28 d分别为(102±67)、(58±77)、(24±6)个/HP,差异有统计学意义(P<0.01)。结论NSCs在小脑变性损害区能够存活、迁移,能够改善KA致小脑变性共济失调症状,提示NSCs移植可成为治疗小脑变性损害的治疗手段。     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能

目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法:取出生后4 d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFP-ADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果:成功获得了稳定表达GFP的ADSCs,GFP-ADSC经成骨诱导20 d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导10 d后油红O染色阳性.结论:GFP作为报告基因在ADSCs分化过程中没有被关闭,亦未影响到ASCs的多向分化潜能,是ADSC在体多向分化研究的一个有效示踪工具.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

目的 测定绿色荧光蛋白转基因小鼠不同年龄段的生理生化、组织病理学等方面的指标,为该品种转基因小鼠应用于毒理学等领域研究提供理论依据.方法 定期测定不同周龄段(4～6周龄,6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄)141只绿色荧光蛋白转基因(GFP)小鼠和100只对照组C57BL/6J小鼠的体重和摄食量,对上述两种动物定期取血,测定血生化及血液学指标.对动物进行大体解剖,计算主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺,性腺)的脏器系数并进行组织病理学检测.结果 ①体重和摄食量:4周龄的GFP小鼠,其体重明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);4～5周龄的GFP小鼠,其摄食量明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01).②血常规测定:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其红细胞计数(RBC)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其白细胞计数(WBC)明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01).③血生化测定:6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其尿酸(UA)值明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其总蛋白(TP),白蛋白(ALB)明显低于对照组,差异具有显著性(P相似文献   

四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立

目的 探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法 构建肝脏特异启动子fabp10启动rtTA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rtTA,联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒转染HeLa细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rtTA联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30礸/ml doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果 共转染pfabp10-rtTA与 pTRE-Tight-BI-AcGFP1的HeLa细胞经1礸/ml浓度doxycycline诱导培养液诱导, GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30礸/ml doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

[摘要] 目的：研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCc)转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰BMSCc的可行性。方法：在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103-1×1010 PFU/ml)转染BMSCc,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β- 巯基乙醇诱导感染Ad-GFP的BMSCc向神经样细胞定向分化。结果：3-6代BMSCc表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性,当病毒滴度为1×107PFU/ml时感染率为55%,为1×109及1×1010PFU/ml感染率均为85%,但1×1010PFU/ml时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d 仍可见荧光表达,感染Ad-GFP的BMSCc经β- 巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染BMSCc,对细胞的生物学特性影响较小不影响诱导分化功能,BMSCc可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。     

研究生实验动物学实验课的教学体会

实验动物学吸纳了生物学、医学、兽医学、遗传学等诸多学科的知识,是一门具有很强的综合性和交叉性的学科。人们普遍认为实验动物是生物医学乃至整个生命科学研究的重要支撑条件之一,在新技术革命蓬勃发展的当今世界中占有重要地位,因而也受到了各个医学院校的高度重视,成为许多学校本科生的选修课和研究生的必修课。实验动物学实验课作为理论知识的验证和补充,也受到学校和学生的高度重视。但由于师资、经费和教学条件的限制,多数学校只能选择性地面向研究生开设实验课。我系对研究生开设实验动物学实验课程已10年有余,对于普及实验动物学的有关知识和研究生的动手能力起到了一定的推动作用。通过长期的实验课教学,作者的有关认识是:     

转绿色荧光蛋白基因小鼠子宫内膜异位症模型的建立和评价

目的建立小鼠子宫内膜异位症种植模型,探讨荧光检测异位子宫内膜的方法。方法将转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠的子宫内膜剪碎后,注射入C57BL/6小鼠的腹腔,喂养含17-β-雌二醇的无菌水,3周后剖检小鼠,在活体荧光成像系统下观察腹腔的绿色荧光,并做免疫组化染色。结果在移植转GFP基因小鼠子宫内膜的C57/BLC57BL/6小鼠的腹腔内存在绿色荧光,且免疫组化证实该异位内膜组织中表达GFP,而对照组均阴性。结论转GFP基因小鼠子宫内膜模型可清晰地显示异位内膜病灶,具有良好的应用前景。     

增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能简

目的分离、培养增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）转基因小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derivedmesenchymalstemcells,ADMSCs）,并研究ADMSC在体外定向诱导下的多向分化潜能。方法分离EGFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,剪碎后胶原酶消化,含10％优等胎牛血清（fetalcalfserum,FBS）的α—MEM培养液培养,取第3代EGFP—ADMsCs进行成骨、成脂诱导,并分别采用茜素红钙盐染色和油红0染色进行鉴定。结果成功获得了稳定表达EGFP的ADMSC;EGFP-ADMSCs经成骨诱导21d后茜素红染色可见橘红色钙盐沉积,经成脂诱导14d后油红。染色阳性,并且分化后细胞的EGFP表达不受影响。结论EGFP转基因小鼠来源的脂肪间充质干细胞具有普通小鼠ADMSCs相同的自我更新增殖和多向分化的干细胞特性,并且能稳定表达EGFP,可以成为研究干细胞修复受损组织的作用机制的有效示踪工具。     

荧光蛋白在肿瘤分子影像研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是在水母中发现的新型报告分子,该蛋白及其衍生物能在多种生物体内表达并发出荧光,是目前在生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。尤其是在肿瘤的研究中,荧光蛋白的分子影像可为深入揭示肿瘤发生发展的病理过程的机制,以及对其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段。     

同源导入近交系绿色荧光裸小鼠Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的建立

目的建立一个能稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)的裸小鼠近交新品系,供包括人脑胶质瘤在内的所有人类肿瘤移植实验用。方法将雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠和雄性Foxn1nu裸小鼠,按同源导入方法进行杂交和回交,用荧光手电筒和匹配的眼镜、多功能活体成像仪、荧光显微镜对是否表达EGFP进行鉴别,传至F10后进行遗传学检测。结果所建品系命名为Foxn1nu.B6-CAGEGFP/SU(Soochow University),14个遗传生化位点中13个表型与BALB/c(Foxn1nu)吻合,唯Pep3(肽酶-3)的电泳为b型,而标准的BALB/c近交系为a型;外周血淋巴细胞占全部有核细胞15%,T淋巴细胞仅占0.3%,与亲本的Foxn1nu一致。结论成功地建立了一个既与亲本C57BL/6-Tg N(CAG-EGFP)-样稳定表达EGFP,又与Foxn1nu裸小鼠(BALB/c背景)一样具有T细胞缺乏的荧光裸小鼠新品系-Foxn1nu.B6-CAG-EGFP|SU,Pep3为b型是有别于Foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点。     

人ATP7B基因在转基因大鼠的铜代谢通路中的功能分析

目的　利用转基因大鼠模型 ,研究人Wilson病致病基因ATP7B在铜代谢通路中的功能。方法　将构建的 7 1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC(long_evanscinnamon)大鼠受精卵的雄性原核。以RT_PCR和Westernblot分析其在转基因大鼠各组织内的表达谱 ;用抗大鼠铜蓝蛋白抗体检测肝细胞全铜蓝蛋白 (holoceruloplasmin)的合成 ;同时对 6～ 30周龄的转基因大鼠血清铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性、血清铜浓度、胆汁的铜分泌量、以及肝、肾和脑组织中的铜含量进行分年龄段连续测定和统计学分析。结果　在转基因大鼠体内 ,ATP7B在各种组织中获得广泛表达 ,其中肝和肌肉中的表达水平较高 ,肝细胞恢复了全铜蓝蛋白的合成 ,血清中的铜含量及胆汁的铜排泄量增加 ,肝、肾组织中的铜蓄积减少。结论　完整表达人ATP7B基因产物的转基因大鼠的肝细胞 ,通过CPN介导的铜向血清的分泌和调节铜向胆汁的排泄 ,恢复了ATP7B参与铜转运功能 ,Wilson病的铜蓄积与ATP7B基因的突变直接相关。     

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。     

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

[目的]为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞.[方法]应用含碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养技术,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白(nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白(NF)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内.[结果]从海马组织分离的细胞具有分裂能力,能表达nestin.分化后一些细胞能表达NF,而另一些细胞则表达GFAP.GFP基因修饰的细胞能发出荧光.[结论]从海马组织分离的细胞能表达nestin,属于神经前体细胞,它们具有明显的增殖能力.有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞.GFP基因已成功转染到神经前体细胞内,并表达了GFP.