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1.
将由SV40早期启动子和小鼠金属硫蛋白基因启动子所控制的人凝血IX因子cDNA的重组基因分别导入培养的小鼠成纤维细胞,发现它们都能被表达。进而将它们分别导入小鼠受精卵雄原核,作成相应的转基因小鼠,则发现它们都失去了表达特性,结果分析表明,在人凝血IX因子cDNA中可能存在着决定其在活体内表达的顺式调节元件。 相似文献
2.
山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ 总被引:9,自引:0,他引:9
为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ(human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♂,3♀),整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。 相似文献
3.
牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控 总被引:1,自引:0,他引:1
构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上 相似文献
4.
AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究 总被引:6,自引:1,他引:5
采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向. 相似文献
5.
采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径. 相似文献
6.
为利用patatin class-I启动子的块茎表达专一性以达到马苓薯的目的,利用PCR技术从马铃薯总DNA中扩增出Pataitn class-I启动子及信号肽基因,并将其克隆;序列分析发现该基因片段与已发表cDNA相应片段约94%同源。 相似文献
7.
脑源神经营养因子基因转染神经断端促进切断坐骨神经再生 总被引:10,自引:1,他引:9
为了研究体内表达的脑源神经营养因子(Brain-derivedNeurotrphicfactor,BDNF)对脊髓运动神经元存活及切断神经再生的作用,我们将人BDNFcDNA克隆到真核表达载体pCB6中,使BDNF基因在CMV启动子控制下表达。在雏鸡出生后3小时内及第二天直接将pCB-BDNFcDNA·lipofectin混合物注射到坐骨神经预切断位点附近肌肉内。第二天切断坐骨神经,神经切断10天后进行实验检测,观察到,BDNFcDNA转染阻止了切断神经一侧的腰脊髓内(L4-L6)运动神经元的大量死亡。并显著的促进了切断坐骨神经的再生。这些结果表明直接注射含BDNFcDNA的质粒对损伤的神经进行基因治疗,具有良好的前景;lipofectin介导重组质粒进行基因转染是导入外源基因到体内的一个可行方法。 相似文献
8.
Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
将Epstein-Bar病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的MA基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。 相似文献
9.
重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
采用定点诱变技术, 将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因, 并构建于AAV载体上, 以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒, 然后, 经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验, 观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果. 结果显示: (i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在, 并持续15周以上; (ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%, 显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%); (iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在; (iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用. 提示: 以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFIX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径. 相似文献
10.
一种强启动子的分离与功能 总被引:5,自引:0,他引:5
以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的番茄叶片组织总DNA为模板,通过PCR反应扩增CLCuV双向启动子片段并插入克隆载体。序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长436bp,与目前发现的4类CLCuV分离物的启动子序列的同源性最高为99.32%。将启动子片段分别以不同方向与gus报告基因和nos终止子融合,构建了瞬时表达载体。通过基因枪法将质粒载体导入烟草(Nicotiana tabacum L.) 相似文献
11.
利用RT-PCR方法,从小鼠肝脏组织总RNA中扩增出4.5SRNA的cDNA。该cDNA被克隆到pGEM3Zf(+)质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Luc基因作为报道基因的表达载体pSVluc20的PvuⅡ位点,构建了含4.2SRNA逆转座子的表达载体pSVluc20-4.5S。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61。结果表明,小鼠4.5SRN 相似文献
12.
逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因mdr-1导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人mdr-1cDNA的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞PA317,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达1.2×105cfu/ml。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性CFU-CM检测,其基因转移效率可达7.0%。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后4个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人mdr-1cDNA,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性 相似文献
13.
CS3纤毛抗原表达调控机理的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
CS3是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素.为了探索CS3菌毛抗原基因的表达调控机制,根据CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的-10区和-35区DNA序列.采用基因重组技术将CS3结构基因上游120bp的DNA片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因lacZ的质粒pCB267中.凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps).将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进pCB267中,报告基因表达结果表明CS3结构基因的表达受其上游区域的抑制.核苷酸序列分析发现,在Ps-35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇.结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用.用CFA/1菌毛抗原基因的正向调节基因cfaD对CS3基因进行的互补表达试验表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力.在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达.同时提出了其表达调控模型. 相似文献
14.
将Epstein-Barr病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白 相似文献
15.
为利用Patatinclass-Ⅰ启动子的块茎表达专一性以达到改良马铃薯的目的,利用PCR技术从马铃薯总DNA中扩增出Patatinclass-Ⅰ启动子及信号肽基因,并将其克隆:序列分析发现该基因片段与已发表的CNDA相应片段约94%同源。 相似文献
16.
逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr—1)导入小鼠?… 总被引:4,自引:0,他引:4
本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因mdr-1导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人mdr-1 cDNA的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞PA317,再经秋水仙素筛选。 相似文献
17.
以基因工程抗原取代天然抗原用于人巨细胞病毒感染的诊断。具有广阔的前景。为此,分离HCMV大外膜磷蛋白pp150基因ORF3’端434bp的DNA片段,导入带有高水平录转启动子Prtc和六个串联组氨酸的原核表达载体 相似文献
18.
为建立人低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD81和浸入诱导蛋白L(Sip—L)等多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,首先分别构建了白蛋白启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L基因的小鼠肝脏组织特异性表达载体,将3种质粒同时采用水动力转染技术导入小鼠体内,FIT—PCR和免疫组化技术检测转入体内基因的表达及持续时间。结果表明,转染8h后即可检测到3种基因在体内转录,人LDLR和CD81在转染1~4d后可在50%-90%的肝细胞中高效表达,7d后检测不到目的基因表达。为了进一步延长转染基因在小鼠体内的表达时间,又分别构建了人LDLR、CD81和Sip—L的染色体整合型表达载体,将它们与噬菌体ФC31的整合酶表达载体同时水动力转染小鼠,3种基因在体内表达时间可持续到转染后25d。以上结果表明建立了多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,为确定这些分子能否使小鼠感染HCV奠定了基础。 相似文献
19.
重组抗体—尿激酶导向溶栓剂的基因构建及表达 总被引:5,自引:0,他引:5
为了获得高效、高特异性溶栓药物,应用基因工程技术,成功的表达了由人源化抗人活化血小板单抗和单链尿酶组成的抗体导向溶栓剂(SZ51Hu-scuPA)。通过基因重组PCR方法将scuPA全长cDNA的N末端连接在SZ51重链恒区CH3末端,构建了含有目的蛋白融合基因的真核表达载体αlys30-SZ51VH/Hu-scuPA。采用脂转染法将表达载体导入分泌SZ51VK/Hu轻链的小鼠骨髓瘤细胞中,筛选出 相似文献