肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD~+再生的耦合

在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中超表达内源甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC,同时引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1,得到耦合3-羟基丙酸(3-HP)合成与NAD+再生的重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h时3-HP产量达到1.45g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

构建组成型肺炎克雷伯氏菌表达系统生产3-羟基丙酸

利用组成型卡那霉素抗性基因启动子(Pkan),在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中过表达大肠杆菌醛脱氢酶基因ald H,获得重组菌K.p(p ETPkan-ald H)。微氧摇瓶发酵表明,该重组菌可高效利用甘油生产3-羟基丙酸,产量为0.47 g/L,较野生菌提高89.5%,甘油转化率、单位菌体产量分别提高100%和92%。5 L发酵罐微氧流加发酵表明,该菌3-HP产量达15.28 g/L,甘油转化率、产率分别为13.02%、12.73%。     

基于sigma因子全局代谢扰动提高克雷伯肺炎杆菌的3-羟基丙酸产量

利用易错PCR技术构建了全局转录机器工程（gTME）关键元件σ因子（rpoD基因）的突变文库,连接至表达载体,电转化K.pneumoniae DSM 2026,并且从大量阳性克隆中筛选出一株3-羟基丙酸（3-HP）高产菌。初步发酵试验表明,该携带突变rpoD基因的工程菌能高效利用甘油生产3-HP,产量达到4.49g/L,比携带野生型rpoD基因的对照菌提高242.75%,甘油转化率、生产强度分别提高了832.50%、239.39%。     

两种消除Klebsiella pneumoniae重组型质粒的方法

对于工业发酵菌种肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),研究发现有两种消除其重组型质粒的有效方法,一种是连续传代培养,另一种是使用消除剂十二烷基硫酸钠(SDS)。对K.pneumoniae重组菌连续20代传代培养后,发现其质粒具有较高的消除率;而以0.2%SDS复合Ca2+处理K.pneumoniae重组菌,也能有效消除其重组型质粒,且该方法省却了反复的传代培养,能快速得到质粒消除菌,更具简便易操作性。消除了质粒的K.pneumoniae能再次接纳新的质粒,有效避免了因质粒不相容性带来的转化不成功,进而可用作宿主菌积累更多的生理性状。     

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(Pdu P)是以甘油为底物催化合成聚3-羟基丙酸的关键酶。本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中PCR扩增了pdu P基因,构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌,得到重组菌K.p(p ET-pk-pdu P)。SDS-PAGE显示Pdu P实现了高效表达。生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期,生物量较空质粒对照菌提高了24.68%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量分别达到16.58 g/L和15.68 g/L,甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了40.62%和34.02%。上述结果表明,过表达pdu P重排了代谢流量,促进了菌体生长。     

budC敲除及ldhA过表达对Klebsiella pneumoniae合成D-乳酸的影响

为了提高K. pneumoniae中D-乳酸的合成效率,本文以BUD和LDH为改造目标,扩增丁二醇脱氢酶基因budC,并在其中插入四环素抗性基因tet,构建了基因敲除载体pTBT,转化K. pneumoniae,利用同源重组技术,敲除K. pneumoniae染色体上的budC基因,得到重组菌K. pneumonia B-;在此基础上,构建了表达载体pKP-ldhA,转化K. pneumoniae B-,过量表达乳酸脱氢酶基因ldhA,得到重组菌K. pneumoniae B-L+。摇瓶发酵结果显示,重组菌K. pneumoniae B-L+的丁二醇合成浓度比原始菌降低了90%以上,D-乳酸合成浓度比K. pneumoniae B-和原始菌分别提高了77.1%和41.4%,发酵罐实验D-乳酸产量68.4g/L,转化率0.78,生产强度1.22g/(L·h)。结果表明,敲除budC及过表达ldhA有利于改善克雷伯肺炎杆菌中D-乳酸的合成。     

pH调控方式对微囊包埋Klebsiella pneumoniae发酵的影响

考察了不控制pH、CaCO3调节pH和KOH调节pH情况下,NaCS/PDMDAAC微胶囊包埋的肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae ZJU5205的菌体生长、底物甘油的消耗和1,3-丙二醇的生成动力学,并同时测定了过程中pH的变化情况。结果表明,通过KOH调节pH,可获得最大菌体生长量和最大的1,3-丙二醇浓度。故对固定化肺炎克雷伯氏杆菌来说,有效调控pH对发酵过程有重要影响。     

反应型阻燃剂3-羟基苯膦酰丙酸的合成

以苯、三氯化磷和丙烯酸等为原料合成了一种重要的磷系阻燃剂羟基苯膦酰丙酸。研究了反应温度、原料配比、置换剂等因素的影响。以苯、三氯化磷合成苯膦二氯的收率达到81％，以苯膦二氯和丙烯酸合成3-羟基苯膦酰丙酸的收率为88％。通过红外光谱和差示扫描量热分析确定了产品的结构。     

2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的合成

以L-乳酸乙酯为原料，经酰化、缩合反应合成了2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯．实验主要考察了催化剂、反应温度与时间、原料配比、溶剂用量、碱用量等因素的影响，荻得了优化的反应条件，收率达90％以上．经红外光谱、质谱对合成的化合物进行了结构袁征。     

4-羟基-3-甲氧基苯乙胺盐酸盐的合成

以香草醛和硝基甲烷为原料,通过缩合、还原和成盐反应,合成了4-羟基-3-甲氧基苯乙胺盐酸盐,并通过IR和1HNMR对其结构进行了表征。进一步探讨了反应温度、催化剂用量和反应物摩尔比对缩合反应产率的影响,以及还原剂的制备、反应温度和反应时间对还原反应产率的影响,还原产率达到66.8%。     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD+

在肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中超表达内源甘油脱水酶基因 dhaB 和醛脱氢酶基因 puuC,同时引入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的3-磷酸甘油脱氢酶基因 GPD1,得到耦合3-羟基丙酸（3-HP）合成与NAD⁺再生的重组菌 K.p (pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h 时3-HP产量达到1.45 g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

过表达生长相关基因对肺炎克雷伯氏菌甘油代谢的影响

在肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中过表达生长调控基因,以携带空载体的重组菌为对照,筛选生物量高且目标产物增加的重组菌。摇瓶发酵 24h后测定各重组菌的生物量、甘油消耗及代谢物产量。研究发现,与携带空载体的重组菌相比,过表达编码核糖ABC转运酶的rbsC基因可使生物量和甘油转化率分别提高16.08%和24.69%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量分别提高39.59%和19.79%;过表达tRNA核苷酸转移酶基因cca可使生物量和甘油转化率分别提高7.17%和19.16%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量分别提高36.24%和13.39%。研究结果表明刺激细菌生长可望促进目标产物的积累。     

肺炎克雷伯杆菌表达吡咯喹啉醌依赖性聚乙烯醇脱氢酶

聚乙烯醇脱氢酶（PVADH）是降解聚乙烯醇（PVA）的关键酶,大肠杆菌或毕赤酵母生产PVADH需额外添加辅酶吡咯喹啉醌（PQQ）才具活性。为了降低添加PQQ的成本,在PQQ天然生产菌肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）中表达全酶PQQ-PVADH。首先通过外源基因密码子优化实现PVADH的高效表达,PVADH酶活达到45 U/mL;进而通过辅酶再生提高PQQ产量,双质粒重组菌Kp（pvadh+pqq）的PVADH酶活达到68 U/mL;最后经发酵优化,PVADH酶活达到81 U/mL,为PQQ-PVADH的生产提供了另一种选择方案。     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

基于全局转录工程促进肺炎克雷伯氏菌吡咯喹啉醌的生物合成

用易错PCR构建肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RNA聚合酶rpoD基因的突变文库,将其与载体连接后转化肺炎克雷伯氏菌,从1500个阳性克隆中筛选出一株吡咯喹啉醌(PQQ)生产菌。发酵试验表明,该工程菌的PQQ产量为76mg/mL,比携带未突变rpoD基因的对照菌提高了10%。测序发现rpoD基因在核酸和蛋白质水平的突变率分别达到2.5%和0.5%。二级结构预测发现α螺旋、β转角和无规则卷曲数目均发生了变化,推测由此改变了σ因子与启动子的亲和程度,从而导致了PQQ基因的转录以及K. pneumoniae代谢流量再分配,使得PQQ得到更高效表达。