棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用.本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB111(GenBank登录号:HQ234875.1),Cdna全长1 001 bp,开放阅读框828bp.通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,GhMYB 11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域.实时定量PCR分析发现,GhMYB 11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调.GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因.本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料     

平榛ChWRKY1转录因子的克隆及表达模式分析

根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR法克隆到1个平榛WRKY基因,全长1273bp,推断其编码317个氨基酸,命名为ChWRKY1。序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只含有1个WRKY结构域,锌指结构为C-X5-C-X23-H-X1-H,构建的系统发育树结果表明,它与杨树PtWRKY5、葡萄VvWRKY4的亲缘关系较近,相似性分别为69%和64%。采用qRT-PCR,以Actin为内参对ChWRKY1基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析,结果显示在自然条件下12月份达到最高的表达量,随后表达量呈现下降的趋势;对平榛根蘖苗进行4℃低温胁迫处理,叶片中ChWRKY1基因快速上调表达,4h达到最大表达量,表明该基因可能参与平榛对低温胁迫的早期应答反应;冬季(1月份)ChWRKY1基因在韧皮部中的表达高于花芽和雄花序,具有组织表达特异性。     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

植物转录因子功能分析方法

植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。通过各种途径已经分离出大量经序列分析推断为转录因子的基因，但由于方法的局限性，其功能特征还研究得很不够。综述概述了当前常用的研究植物转录因子功能的分子生物学方法，同时介绍了一些研究植物转录因子功能的新方法，如双链RNA和基于糖皮质激素受体的基因诱导表达。     

WRKY转录因子表达谱的研究进展

环境胁迫对植物的生长发育造成重大影响,因此,提高植物的抗逆性是农业面临的重要问题。自然界中存在多种抗逆基因,如抗盐基因、抗旱基因、抗寒基因等。利用植物基因工程和分子生物学技术提高植物对逆境的适应性及其抗逆分子机制的研究已成为当今热点。WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子,本文综述了WRKY转录因子家族的结构特点、WRKY转录因子在非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐）、外源物质（激素及O3）处理及生物胁迫下的表达模式。各种胁迫下的表达谱均呈现不同特点,这些差异表达可能与它们所行使的不同生物学功能有关。     

梨火疫病菌luxR转录调节因子的克隆与功能分析

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)是一种具有毁灭性的植物病原细菌,能够侵染梨、苹果和其他蔷薇科植物引起火疫病,造成严重的经济损失。luxR家族调控因子具有重要的生理生化作用,是细菌群体感应机制中研究较多的一类重要的转录调节基因。本研究采用PCR技术从梨火疫病菌中扩增出一个luxR同源基因,命名为EaluxR,应用同源重组的方法构建了突变株(EaΔluxR),并对其功能进行初步研究。实验结果表明,EaΔluxR与野生型菌株相比产生的多烯大环内酯类代谢产物在抗氧化压力和生长情况方面有明显差异,对梨幼苗及幼果的致病能力下降;但是EaΔluxR仍能引起烟草过敏性反应,并且在抗生素耐受水平和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异。研究表明,梨火疫病菌对病菌的生长、次级代谢产物、抗氧化压力以及致病性方面具有关键作用,为深入认识梨火疫的群体感应系统提供了科学依据。     

WRKY转录因子参与植物非生物胁迫应答的研究进展

WRKY转录因子在植物的非生物胁迫中发挥了重要的调节作用,能够参与多种不同的信号途径,功能具有多样性。WRKY蛋白除具有高度保守的WRKYGQK基序外,通常还具有Cys2His2或Cys2His-Cys型锌指结构,它通过与靶基因启动子中的W-box[(T)TGACC(A/T)]特异结合调控其表达,从而响应植物的逆境胁迫及其它信号途径。为了帮助我们更全面地了解WRKY转录因子在植物中的作用,本文主要对近年来WRKY在植物非生物胁迫方面的研究进展进行了综述。     

WRKY转录因子调控植物养分吸收利用及重金属解毒的研究进展

WRKY蛋白是植物特有的一类重要转录调控因子,它们通过与下游基因启动子上的W-box元件特异性结合诱导或抑制相关基因的表达,从而调控植物生长发育以及植物对生物和非生物胁迫的响应。植物WRKY基因组数目多,在拟南芥、大豆和水稻基因组中已经分别鉴定出74、182和109个,在植物对干旱、盐害、高温、养分匮乏和病原体感染等各种生物、非生物胁迫的响应过程中起关键作用。例如AtWRKY45和AtWRKY75参与调控拟南芥应答低磷养分胁迫,GmWRKY142正向调控拟南芥对镉胁迫的耐受性。在植物面对逆境胁迫时,WRKY蛋白通过与养分相关基因启动子的W-box元件特异性结合,进而实现自我调节或交叉调节,激活或抑制下游基因的转录以应对各种逆境胁迫。众多WRKY下游靶基因也已被鉴定出来,例如PHT家族成员与磷营养相关;3个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因参与调控植物对氮素的吸收利用;6个拟南芥WRKY基因、10个大豆WRKY基因和5个水稻WRKY基因调节植物应对低磷胁迫;2个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因影响植物对钾的吸收利用;3个大豆WRKY基因参与调控植物对硫营养的吸收利用;1个拟...     

森林草莓全基因组WRKY转录因子基因的鉴定与分析

WRKY转录因子是一类重要的调控分子,在高等植物中以基因家族的形式存在。本研究以森林草莓基因组数据为材料,利用生物信息学手段对WRKY转录因子进行全基因组鉴定与分析。结果表明,森林草莓至少有56个WRKY转录因子,蛋白序列长度为58～1982个氨基酸;基因组DNA全长1092～14227bp,具1～20个内含子。染色体定位结果表明,7条染色体上均有WRKY转录因子基因的分布,6号染色体上最多(17),1号染色体分布最少(1)。森林草莓WRKY转录因子可分为3大类,Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类的数量分别为10、34和12,它们处于进化树的不同分支。除保守的WRKYGQK和常见变异序列WRKYGKK外,新发现WKKYGQK、WRKSYFR等WRKY结构域类型。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

乙烯利处理对棉花子叶DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片早衰影响棉花产量和棉纤维质量,而乙烯利是一种重要的植物生长调节剂,对促进植物组织衰老有重要作用。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在高等植物的基因表达调控中发挥了重要作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,探讨在不同乙烯利水平处理下,棉花子叶DNA甲基化水平和甲基化变化模式。结果显示,经300、500和700 mg/L乙烯利处理后,棉花子叶DNA甲基化比值分别为32.99%、35.45%和37.49%,都低于对照组(37.92%);和对照组相比,经不同浓度乙烯利处理后,棉花子叶DNA发生甲基化变化位点的比率分别是2.71%、3.63%和4.88%,而去甲基化位点的比率分别为10.66%、9.84%和9.23%,并且随着乙烯利浓度的增加,棉花子叶DNA甲基化位点与去甲基化位点之比逐渐提高;本研究鉴定了17个MSAP差异基因片段,这些片段与NCBI中已知的功能基因存在同源性,包括果胶甲酯酶基因、细胞色素P450、乙醇脱氢酶基因、肌动蛋白解聚因子、翻译延伸因子等和乙烯利诱导棉花子叶衰老相关基因。研究结果提示,在乙烯诱导棉花子叶衰老的进程中,DNA甲基化参与了棉花子叶衰老的调控,为从基因组水平上揭示乙烯诱导棉花衰老的调控机制提供理论依据。     

膜下滴灌条件下棉株温湿度微环境

通过对膜下滴灌棉花根区土壤温度、水分、冠层叶温、气温及冠层空气湿度的观测,分析了该灌水条件下棉花土壤水、热关系,冠层温、湿度关系,结果发现:棉花根区土壤水分与温度之比在深度方向上近似呈线性关系,冠层叶—气温差与空气饱和差也呈线性关系,说明膜下滴灌技术能够为棉花根系提供良好的吸水环境,有利于棉花生长。     

棉花Bax inhibitor-1基因启动子的克隆及初步验证

为研究克隆自陆地棉的GhBI-1A和GhBI-1B基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的分子机制,利用BD GenomeWalkerTM Universal Kit的染色体步移技术得到了2个棉花GhBI-1A和GhBF1B基因5’端上游的启动子序列,长度分别为1650bp和2001bp.生物信息学分析表明,GhBI-1A和GhBI-1B的启动子序列均存在TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,GhBI-1B启动子中还含有真菌诱导应答元件.以表达载体pBI101为基础,用所克隆的2个棉花GhBI-1基因启动子序列与GUS报告基因融合,构建新的植物表达载体并转入农杆菌.用叶盘法侵染烟草进行瞬时表达,结果表明2个启动子均能够驱动报告基因的表达.     

膜下高频滴灌对土壤温湿环境及棉花产量的影响

以田间试验为基础,对高频覆膜滴灌条件下土壤水分、温度以及棉花的耗水过程和生长状况进行了观测。结果表明,高频滴灌条件下,灌水次数及灌水量分别比对照多20次和596.2mm,土壤含水率水平较高,棉花根系吸水阻力小,耗水强度大,可达7.4mm/d。各生育阶段高频滴灌的土壤温度比对照低,而且根系分布浅。另外,高频滴灌棉花地上营养器官生长旺盛,叶面积指数很大,可达到6.6。然而,高频滴灌棉花产量比对照低111.34kg/hm2,水分利用效率低。试验认为高频滴灌的生产意义不显著。     

转录组分析揭示了棉花根系盐胁迫调控的生物进程和主要代谢途径

高盐是限制棉花生长和生产力的主要因子。研究报道,植物响应高盐主要是由参与离子和渗透压平衡信号、解毒和生长调节等途径来控制的,同时植物对渗透胁迫的应答还影响脱落酸(ABA)的代谢和信号传导途径、盐胁迫和干旱胁迫是紧密相关的。植物遭遇盐胁迫的时候,根部是最敏感的,在受到盐胁迫的棉花幼苗中,根的长度和鲜重减少的程度远远大于子叶下胚轴。     

转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cryIAc基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用.目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道.为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测方法.所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态.建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝.用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体.采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定.结果表明,有1份含量在1.5％左右,4份含量超过了20％,两种方法的测定结果基本一致.本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值.     

Variability of cotton (Gossypium hirsutum L.) with regard to earliness

Eighty cotton varieties (Gossypium hirsutum L.) from the collection of VIR (N.I. Vavilov Research Institute of Plant Industry, St. Peterburg, Russia) collection were studied for variability with regard to the duration of their vegetation period. The experiments were carried out in the conditions of the marginal zone of the cotton growing area, that is the city of Krasnodar in the Russian Federation. Thirty-four varieties were studied in 1996–1998, forty-six varieties in 1997–1998. The purpose of this research was to determine the threshold of sensitivity in the varieties of the duration of the period of vegetative growth, which depends upon weather conditions, and to record variations in morphological characters associated with earliness. The data obtained were processed by the method of statusmetry. The mathematical models which were constructed showed the relationship between the criteria for earliness and other morphological and agronomic characters of the plants.     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。