酒精性肝纤维化基质降解机制的研究

为揭示酒精性肝病（ALD）肝纤维化基质降解的病理机制，28例ALD肝穿刺组织按其纤维化程度分为3组，应用原位杂交技术分别检测各组肝组织内基质金属蛋白酶－1（MMP－1）、基质金属蛋白酶－2（MMP－2）、膜型基质金属蛋白酶－1（MT1－MMP） mRNA和基质金属蛋白酶抑制酶－1（TIMP－1） mRNA的表达。结果发现，MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA阳性细胞主要位于纤维化的中央静脉、窦周及汇管区等部位周围，且MMP－2和MT1－MMP mRNA的表达细胞有重叠，MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA表达阳性细胞数随肝纤维化程度的加重而增多，而MMP－1 mRNA表达阳性细胞数减少，且以纤维化中期变化为著；MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1 mRNA表达阳性细胞主要为肝窦壁细胞，少数肝细胞亦呈阳性表达，提示MMP－1养活和TIMP－1增多可能是ALD肝纤维化过程中细胞外基质（ECM）沉积、尤其是Ⅰ型胶原过量沉积的病理机制之一；MMP－2和MT1－MMP在基质降解过程中可能有协同作用，其表达增多可能对ALD时中央静脉纤维化、肝窦血管化起一定促进作用；肝窦壁细胞（肝星状细胞等）为肝组织内MMP－1、MMP－2、MT1－MMP和TIMP－1的主要产生细胞。     

重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠基质分解素—1基因表达的影响

为了解重组人肝再生增强因子（hALR）对肝纤维化大鼠基质分解素－1（MMP3）基因表达的影响,建立CCl4中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型,模型完成后予不同剂量hALR治疗,在不同的时间点留取大鼠肝组织标本,提取总RNA,用逆转录定量聚合酶链反应（RT－PCR）测定MMP3的基因表达。结果在两种模型中hALR治疗组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平在治疗过程中的不同阶段均明显高于模型组;高剂量hALR组大鼠肝组织基质分解素－1的基因表达水平均明显高于低剂量组,提示hALR可增强肝纤维化大鼠MMP3的基因表达。     

复方鳖甲软肝片抗肝纤维化机制的实验研究

目的　研究复方鳖甲软肝片 (FFBJRGP)抗肝纤维化作用机制 ,为FFBJRGP的临床应用及抗肝纤维化药物的研发提供参考。方法　应用Chevallier半定量计分系统、酶图法、免疫组织化学、核酸原位杂交及图像分析等技术方法 ,系统观测高、中、低剂量FFB JRGP治疗CCl4诱导肝纤维化模型后各时间段肝组织内关键性纤维化指标的变化 ,包括主要细胞外基质 (ECM)蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)表达量及酶活性 ,肝星状细胞 (HSC)的活化与增殖状况 ,以及MMP和膜型MMP(MT MMP)mRNA的表达等。结果　与对照组比较 ,不同剂量FFBJRGP治疗 3个月、6个月结束时及停药后 3个月和 6个月肝组织Chevallier纤维化评分均明显减少(P <0 0 1或P <0 0 5 )。各观察时间段肝组织内TIMP 1和TIMP 2表达量不同程度减少 ,其中高、中治疗剂量组于治疗 3个月结束时降至最低 ,而MMP 2、MMP 13酶降解活性达高峰 ,并维持较高水平至停药后 3个月 ,MMPs和MT MMPs酶蛋白及mRNA表达明显上调 ,肝组织内TGF β1及其mRNA表达、α SMA阳性HSC数量显著减少 ;Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原降解幅度与MMPs及MT MMPs表达量及酶活性大致呈平行关系。结论　FFBJRGP可能通过多靶位影响肝纤维化逆转及形成环节产生抗肝纤维化疗效     

维生素E对肝纤维化大鼠肝内转化生长因子β1基质金属蛋白酶-1mRNA表达的影响

目的：研究维生素E（VE）防治肝纤维化可能存在的作用机制。方法：用40％CCl4皮下注射9周制作大鼠肝纤维化模型，在肝纤维化形成后，治疗组用5％VE乳剂静脉注射（100mg/kg,2次／周）连续10周。于治疗后10周取各组肝组织作病理检查，并用原位杂交技术检测肝组织转化生长因子β1（TGF－β1）、基质金属蛋白酶－1（MMP－1）mPNA表达，对检测结果进行图像分析。结果：治疗组肝脏纤维组织沉积较对照组减少，TGF－β1mRNA表达明显低于对照组，经图像分析与对照组差异有显著性（P＜0．01）。MMP－1mRNA的表达两组之间未见显著差异。结论：维生素E可能通过下调TGF－β1mRNA表达，减缓大鼠肝纤维化。     

胃癌组织中膜型1-基质金属蛋白酶的表达

目的 探讨膜型1－金属蛋白酶在胃癌组织的表达以及与胃癌侵袭和转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP方法检测了47例胃癌组织MT1－MMP的表达，采用秩和T检测进行临床病理资料分析。结果 MT1－MMP在正常胃组织中几乎不表达（1／15），而在胃癌组织中高表达（42／47）。进展期胃癌表达（41／42）明显高于早期胃癌（1／5）（P＜0．01），肠型胃癌（24／28）和弥漫型胃癌（12／12）均高表达MT1－MMP，但弥漫型胃部的表达更显著（P＜0．01），浆膜侵袭组表达（32／33）与非浆膜侵袭组（10／14）的差别有非常显著的意义（P＜0．01），淋巴结转移组（31／32）与非淋巴结转移组（11／15）的差别有非常显著的意义（P＜0．01）。MT1－MMP表达定位在胃癌侵袭生长的边缘区，其中以瘤细胞为主，部分基质细胞也表达。分布形式主要有两种。带状分布主要见于肠型胃癌的粘膜，粘膜下层以及肠型胃癌和弥漫型胃癌的肌层侵袭。弥漫性分布多见于弥漫型胃癌的全层侵袭。结论 MT1－MMP表达促进胃癌的的胃壁侵袭和淋巴结转移，可作为判断胃癌恶性表型有有用指标。     

IgA肾病肾血管纤溶酶原激活物抑制物—1和基质金属蛋白酶—9的表达及意义

为探讨免疫球蛋白A肾病（IgA肾病）患者肾血管壁纤溶酶原激活物抑制物－1（PAI－1）、基质金属蛋白酶－9（MMP－9）、金属蛋白酶组织抑制物－1（TIMP－1）和α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）的表达及意义，采用免疫组织化学技术检测38例IgA肾病肾组织血管壁的PAI－1、MMP－9、α－SMA和TIMP－1的蛋白表达。结果显示，α－SMA主要表达于平滑肌细胞；PAI－1表达与α－SMA类似； MMP－9在平滑肌细胞和内皮细胞均表达，TIMP－1仅在血管壁内膜的内皮细胞微弱表达，在IgA肾病Lee Ⅳ-Ⅴ级组，肾血管壁的PAI－1、MMP－9和α－SMA表达显著高于LeeⅠ-Ⅲ级组（P＜0．01）。直线相关分析显示, 肾血管的PAI－1、MMP－9和α－SMA表达与肾小管间质的纤维化和炎细胞浸润呈正相关（P＜0．01）。提示PAI－1可能参与介导了IgA肾病肾血管壁细胞外基质的积累过程，MMP－9则可能促进血管的平滑肌细胞迁移和内膜增生。     

IL-1β、TNF-α对大鼠肝星状细胞MMP13基因表达的调节

为了解白介素－1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）对大鼠肝星状细胞间质胶原酶（MMP13）基因表达的影响,在培养的肝星状细胞系中加入IL－1β、TNF-α于不同的时间点收集细胞,提取总RNA,用逆转录定量PCR方法测定MMP13的基因表达水平。结果表明,IL－1β组肝星状细胞MMP13基因表达水平在8,24,48h三个时间点均明显高于对照组,24h达高峰,为对照组的3倍;TNF－α组肝星状细胞MMP13的基因表达水平在8,24,48,72h均明显高于对照组,48h达高峰,为对照组的4倍。上述结果提示IL－1β、TNF-α可增强肝星状细胞MMP13基因的表达。     

高血糖对肝纤维化大鼠肝组织α—SMA和CTGF表达的影响

目的探讨高血糖对肝纤维化大鼠肝组织α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA反映肝星状细胞HSC活化）和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法将52只SD雄性大鼠随机分为糖尿病肝纤维化组、正常血糖肝纤维化组与正常对照组。通过链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导糖尿病,后用四氯化碳诱导肝纤维化。肝组织HE染色检测病理改变。免疫组化法检测肝组织α－SMA、CTGT蛋白表达。结果高血糖肝纤维化组α—SMA（灰度值142．5±3．67）和CTGF（灰度值144．2±5．01）表达水平较正常血糖肝纤维化组（α—SMA灰度值158．9±2．18,CTGF灰度值157．7±6．80）显著升高（P〈0．05）。结论高血糖可通过诱导肝脏α—SMA、CTGF表达,加重大鼠肝纤维化的程度,促进肝纤维化的形成。其机制与促进肝星状细胞的增殖活化及细胞外基质的合成分泌等有关。     

表皮生长因子、基质金属蛋白酶与汗腺发生相关性的实验研究

探讨胚胎期汗腺发生过程中表皮生长因子（EGF），基质金属蛋白酶－2（MMP－2）和MMP－7与汗腺发生的相关性。为诱导表皮干细胞向汗腺细胞定向分化奠定基础，分别取13－31周胚龄人胎儿背部全层皮肤，以免疫组织化学染色法（SP法）动态观察汗腺胚芽细胞或汗腺细胞及其周围局部基质对基质金属蛋白酶MMP－2，MMP－7与EGF及汗腺胚芽细胞或汗腺细胞对细胞角蛋白－7（K7）蛋白质表达情况，并以原位杂交法动态观察汗腺芽细胞或汗腺细胞MMP－2，MMP－7的mRNA信号特征，结果显示，MMP－2，MMP－7，EGF在14－20周于汗腺细胞及避部基质蛋白质表达逐渐加强，20－22周达峰值，并维持至所观察的全时段，MMP－2，MMP－7的mRNA信号强弱在汗腺胚芽细胞或汗腺细胞中与其蛋白质表达相吻合；K7始于14－16周在汗腺芽细胞内表达，并持续存在，研究表明，汗腺于胚龄14－16周开始发生，至第24周基本成熟，汗腺发生与MMPs所致细胞外基质改建，EGF间的相互作用密切关联。     

组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）是体内重要的水解酶之一,几乎能降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的所有成分;基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinasas,TIMPs）是MMPs的内源性抑制系统．近年来发现,MMPs／TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切,可从多方面影响肝纤维化的形成。通过干扰MMPs与TIMPs基因的表达,研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。     

金属蛋白酶组织抑制因子-2在大鼠肝组织中的定位及表达

用人血白蛋白攻击的方法制备实验性免疫性肝纤维化大鼠模型，以正常大鼠为对照。采用免疫化法及原位杂交技术分别检测肝脏中金属酶组织抑制因子－2在正常及实验性免疫性肝纤维化大鼠肝组织中的定位及表达状态。结果为实验组肝脏中TIMP－2mRNA和相关抗原表达在肌纤维细胞、成纤维细胞，以汇管区及纤维间隔中最明显，阳性信号位于细胞胞浆中，未见细胞核表达。提示在肝纤维化中，成纤维细胞及肌成纤维细胞是TIMP－2表达的主要细胞，并随着病损肝脏中肝纤维化程度的加重，TIMP－2基因和蛋白表达水平随之增高。     

192Ir血管内放射治疗对血管成形术后I型胶原表达的影响

探讨^192Ir血管内放射治疗对血管成形术后I型胶原表达的影响及其机制。小型猪髂动脉再狭窄模型，成形术后随机分为放疗组（血管数n=6)和对照组（血管数n=18)，分别于术后12周及24周取材进行I型胶原、MMP－1及TIMP－1的免疫组化染色和I型胶原mRNA原位杂交并进行定量研究。结果显示，放疗组I型胶原蛋白、mRNA及TIMP－1／MMP－1比值均低于对照组，对照组I型胶原mRNA表达高峰在24周，而放疗组表达高峰在12周。提示^192Ir血管内放射治疗通过抑制I型胶原的合成和调节MMP－1及TIMP－1的活性而影响血管成形术后细胞外胶原的代谢。     

类胰蛋白酶对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的观察类胰蛋白酶对肝星状细胞（HSC）增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，探讨类胰蛋白酶在肝纤维化中的作用。方法用Percoll密度梯度离心法分离、培养大鼠HSC，经系列浓度类胰蛋白酶作用后，分组进行如下实验：用噻唑兰比色法（MTT）检测HSC的增殖；用RT—PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果肥大细胞（MC）类胰蛋白酶（1-100ng／m1）能够促进HSC增殖及Ⅰ型胶原mRNA的表达，此作用呈剂量依赖性（各实验组与对照组比较，P〈0．05）。结论肥大细胞类胰蛋白酶可直接作用于HSC，参与肝纤维化过程。     

自身免疫性肝炎患者肝组织纤维化机制的研究

目的 探讨自身免疫性肝炎(AIH)肝纤维化的机制。方法 以突触素(SYN)标记36例AIH患者肝穿刺标本的肝星状细胞(HSC),采用免疫组化方法检测HSC、Ⅰ型胶原(ColD、Ⅳ型胶原(ColⅣ)及膜型基质金属蛋白酶1(MT-MMP-1)的表达,原位分子杂交方法(ISH)检测MT-MMP-1 mRNA及组织型金属蛋白酶1(TIMP-1)mRNA的表达。结果 36例AIH肝组织内SYN阳性HSC主要分布于汇管区、细胞纤维间隔及肝小叶炎症活动部位,尤其活动性界面炎部位往往呈聚集性分布,周围易见胶原纤维沉积,SYN阳性HSC数量与AIH肝组织活动指数(HAl,Knodell)呈正相关关系。ColⅠ、ColⅣ的表达量随AIH肝纤维化程度的增加而增加。ColⅣ主要分布于活动性炎症区域并随塌陷窦壁呈聚集性分布,ColⅠ主要见于纤维间隔及汇管区内,为S5～6期(Knodell)AIH肝组织内主要的细胞外基质(ECM)成分。MT-MMP-1及其mRNA阳性细胞主要见于汇管区周围界面炎及细胞纤维间隔边缘部位间质细胞内,周围少部分肝细胞亦呈阳性表达。MT-MMP-1及其mRNA表达与AIH肝组织HAI密切相关,且随AIH肝纤维化分期而增强,于S4～5期(Knodell)表达量最高,其后有所下降。AIH肝组织内TIMP-1的表达随肝纤维化的进展大致呈递增趋势。结论 AIH免疫损伤致反复持续性活动性炎症引起HSC的大量活化、增殖,进而引起ECM的沉积可能是AIH肝纤维化发生和进展的重要原因之一;MT-MMP-1引起ColⅣ的降解,改变HSC周围的微环境而诱导HSC的激活可能是HSC活化、增殖的机制之一;AIHECM的降解水平相对低下可能是AIH肝纤维化进展的另一重要机制。此外,本实验结果显示,SYN是研究肝纤维化组织内HSC的一个较好的标志物。     

基质金属蛋白酶及其抑制物在大肠癌表达的定量分析

为探讨基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)及其组织型基质金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP)的表达与人大肠癌转移及其预后的关系,利用S-P免疫组化方法,检测了41例大肠癌组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达情况,并应用计算机图像分析系统作定量分析.结果显示,在肿瘤组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达量明显高于正常大肠组织;淋巴结转移的组织中,MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达量明显高于非淋巴结转移的组织,三者高表达水平与大肠癌的进展有关,并且预后不良.提示基质金属蛋白酶及其抑制物与大肠癌转移及预后密切相关.     

人HUT78细胞褪黑素受体的基因与蛋白表达的研究

为了检测人HUT78细胞是否存在褪黑素受体（melatonin receptor,MR)及其亚细胞分布特点，采用异硫氢酸胍－苯酚－氯仿一步法抽提总RNA，进一步通过RT－PCR方法检测MR亚型mt1和MT2的mRNA，并将RT－PCR的阳性产物通过自动测序仪测序；同时应用免疫组化染色方法检测mt1和MT2受体亚型蛋白在HUT78细胞内的分布特点，RT－PCR方法则得到了368bp mt1 cDNA片段，无321bp MP2 cDNA片段，同时将mt1阳性条带通过胶回收，测序，结果显示扩增产物与人mt1受体亚型的基因序列相吻合，免疫组化结果显示，人HUT78细胞存在mt1受体蛋白，主要分布于细胞膜和细胞浆，呈棕褐色阳性颗粒，而细胞上未见阳性颗粒，MT2受体蛋白则未检出，提示褪黑素（melatonin,Mel)对T淋巴细胞具有直接调节作用，为研究生理及病理情况下Mel调节免疫系统的作用机制奠定了基础。     

基质金属蛋白酶-1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶-1(MMP-1)特异的RNA干扰质粒载体.方法 根据GenBank 数据库提供的MMP-1基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA (Short hairpin RNAs,shRNA) 的DNA 序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法 进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体(pWH1-MMP1)稳定转染至人腺样囊性癌ACC-M细胞系后,应用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot对细胞MMP1的表达进行检测.结果 在成功转染pWH1-ACC-M表达载体的ACC-M细胞中,MMP1 mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 成功构建了MMP1特异性shRNA表达载体,可有效地沉默MMP1基因,为进一步研究MMP1表达与腺样囊性癌增殖和转移的相关性奠定了一定的实验基础.