人食管上皮细胞原代培养方法的研究

目的探讨适用于组织工程食管研究的食管上皮细胞培养方法.方法对比食管上皮细胞在无血清培养基K-SFM及含血清培养基DMEM中的生长情况.结果食管上皮细胞在无血清培养基K-SFM中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染.结论应用无血清培养基K-SFM培养食管上皮细胞,方法简便,适合推广应用.     

湖北钉螺细胞原代培养的初步研究

目的研究湖北钉螺组织细胞的原代培养。方法无菌处理并解剖钉螺成螺及螺胚,分别获得软体、肝脏、外套膜及胚胎组织。将软体、肝脏及胚胎组织剪碎,用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)混合液4℃下消化数小时,所得细胞按三宅的湿润系统固定法接种于钉螺的外套膜组织。培养液为1/2浓度的RPMI1640含20％小牛血清附加常量抗生素(青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml),温度为27℃～28℃,pH7.2～7.4。结果钉螺的胚胎组织冷消化后,获大量游离细胞。接种培养5d,见有贴壁细胞,扁平状,多边或不规则形,大小约为(15～20×12～15)μm。培养细胞以悬浮状为主,直径为8～12μm,少数为30～35μm。生长良好,可传代培养。结论钉螺胚胎细胞可进行原代培养及传代。     

一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

背景：原代培养的人正常胃黏膜上皮细胞与体内姊妹细胞相似，是进行胃生理和病理研究的理想工具，但我国尚未见简便、可靠的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法的报道。目的：探讨简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法。方法：以胶原酶Ⅱ和分散酶磁性搅拌分离人正常胃黏膜上皮细胞。以甲基噻唑基四唑（M1Tr）比色法检测细胞活力，以观察细胞大体生长过程；以溴脱氧尿苷（BrdU）标记法检测S期细胞数量，以观察细胞微观增殖能力。以PAS染色鉴定胃黏膜上皮细胞黏原颗粒；以细胞角蛋白（CK）-18免疫荧光染色鉴定上皮细胞。以光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态结构。初步观察传代细胞的贴壁生长情况。结果：培养第2～3d．胃黏膜上皮细胞活力增幅最大．第4d达最高点，之后逐渐下降；BrdU孵育18h后，33．3％的细胞处于和曾经处于S期。接种密度高时，细胞PAS染色均呈紫红色，可见细胞核旁黏原颗粒；接种密度低时，仅成团细胞PAS染色呈阳性；培养第3d，绝大部分细胞CK-18阳性。接种第2d，胃黏膜上皮细胞成团簇状生长，增殖迅速，第4d后逐渐停止生长．第5d开始出现漂浮死亡细胞，最终完全被成纤维细胞取代；透射电子显微镜可见微绒毛、分泌颗粒、连接复合体等上皮细胞特征。传代胃黏膜上皮细胞增殖、铺展能力较原代细胞降低。结论：磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的人正常胃黏膜上皮细胞。     

建立十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系的核型

目的:应用12色荧光原位杂交技术(multicolor fluorescence in situ hybridization,M-FISH)鉴定食管癌细胞系KYSE450的染色体畸变．方法:采用DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primer-polymerase chain reaction)法混合标记两组多色painting探针,先后两次杂交到相同的KYSE450染色体片,结合反相DAPI显带技术进行核型分析．结果:成功地建立了一种重复的12色荧光原位杂交技术,并鉴定出KYSE450中存在的畸变染色体．该细胞系共有54条染色体,只有13, 21和X号染色体是正常的,其余21条染色体均表现异常．1,2,3,5,6,8,9,14,15,16和17号染色体部分区带增益,4和18号染色体部分区带缺失．7,11,12和19号染色体同时存在区带增益和其它部分区带缺失．1,2,3,4,5,6,7,8,9, 11,12,14,15,16,17,18和19号染色体显示有易位．22号染色体丢失1条,未检测到10,20,Y 染色体成分．结论:12色荧光原位杂交可用于鉴定肿瘤中复杂的染色体异常．KYSE450存在较多与原发性食管鳞癌一致的染色体改变．     

人肾嗜酸细胞癌细胞系CG-6327建立及其生物学特性研究

取1例肾癌患者(男性)手术切取的癌组织块(1 cm×1 cm×1 cm),剪碎后直接接种于细胞培养瓶内行组织块法体外培养.结果接种后4 d组织块周围有少量上皮样细胞爬出,7～10 d爬出细胞增加,增殖较快.14 d形成单层细胞.对获得的人肾嗜酸细胞癌细胞系CG-6327(简称CG)行形态分析,证实其具有恶性肿瘤特征,细胞形态不变,生长周期恒定.本研究成功建立了人肾嗜酸细胞癌细胞系,为肾癌的基础研究提供了实验模型.     

小鼠甲状腺细胞原代培养及鉴定

目的分离培养小鼠甲状腺细胞，为探讨甲状腺功能调节和疾病发生提供一种体外模型。方法取6～8周龄Balb／c小鼠甲状腺，用胶原酶-中性蛋白酶双酶法分离甲状腺滤泡上皮细胞。用含10％胎牛血清（FCS）的F-12培养基培养，细胞贴壁后FCS降至5％，另外添加促甲状腺激素（TSH）、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素和L．谷氨酰胺。光镜下对不同培养时间的细胞进行形态学观察，并结合免疫细胞化学染色法、RT—PCR法和电化学发光免疫法对培养小鼠甲状腺细胞从形态、甲状腺球蛋白（取）、取特异抗原蛋白表达、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘转运子（NIS）、促甲状腺激素受体（TSH—R）等特异基因mRNA表达和甲状腺激素T3、T4分泌功能等方面进行鉴定。结果小鼠甲状腺细胞在体外呈贴壁式生长，具有上皮样细胞特点；取染色呈胞浆阳性，并具有特异TPO、Tg、NIS、TSH—RmRNA表达和分泌T3、T4的功能，但其表达与分泌量有随培养时间的延长呈递减趋势。结论成功建立小鼠甲状腺细胞原代培养模型，可用于甲状腺功能与疾病研究。     

神经母细胞瘤体外细胞系的构建方法

目的 对神经母细胞瘤(NB)进行体外培养，探讨神经母细胞瘤(NB)体外建系的方法。方法 NB患儿新鲜手术标本，采用组织块培养法、酶消化培养法建立原代细胞系；用选择性酶消化法和机械刮除法进行细胞纯化；从细胞形态学、神经特异性烯醇化酶染色、软琼脂克隆形成实验三方面对细胞进行初步鉴定，证实所培养细胞是否为NB细胞。结果 两种细胞培养法均可培养出NB细胞，纯化后可得形态均一的细胞系。结论 可采用适当的细胞培养方法建立神经母细胞瘤的体外细胞系。     

影响人胃癌原代细胞纯化培养结果的临床因素分析

为了给胃癌体外药敏试验提供纯的原代胃癌细胞 ,本研究取手术切除的新鲜胃癌组织 ,进行体外增殖、纯化培养 ,观察影响细胞培养结果的因素 ,并进行了分析。现报告如下。1　资料与方法1 .1　临床资料　 5 9例胃癌患者 ,男 40例 ,女 1 9例 ,年龄 2 7～ 71岁 ,平均 (5 2 .8± 1 2 .1 )岁。均经病理检查确诊 ,其中高分化腺癌 2例、中分化腺癌 1 0例、粘液腺癌 6例、印戒细胞癌 3例、低分化腺癌 3 8例 ,前二者归为分化较好组 ,后三者归为分化较差组 ;分期采用公认的国际 TNM分期法 , 期 9例、 期 1 2例、 期2 5例、 期 1 3例。1 .2　方法　 5 …     

乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定

目的 :建立一套可靠的窦房结细胞培养与鉴定技术。方法 :取Wistar乳鼠的窦房结组织 ,用差速贴壁技术及BrdU处理法进行原代细胞培养 ;对培养细胞进行形态学观察 ,用电生理技术记录细胞的动作电位。结果 :在培养的窦房结细胞中观察到有 3种不同形态的细胞 ,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞 ,其中梭形细胞最多 ,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点。三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。结论 :①用差速贴壁技术及BrdU处理法进行乳鼠的窦房结细胞培养 ,是一种可靠的窦房结细胞培养技术。②培养乳鼠窦房结细胞中的梭形细胞即为窦房结的起搏细胞     

猪RPE细胞原代培养及其透射电镜观察

目的建立视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium RPE）细胞体外培养及其超微结构研究方法，为在细胞和分子水平上对RPE细胞进行研究奠定基础。方法采用酶消化法对RPE细胞进行取材和培养，利用光镜和透射电镜观察及分析培养的RPE细胞。结果建立了可获得大量RPE细胞的培养方法，对培养的细胞进行了系统的观察和分析：培养的细胞贴壁生长，细胞内可见大景黑色素颗粒。结论成功的进行了RPE细胞培养，为各种损伤致RPE细胞形态学改变的研究奠定了基础。     

成人肾脏足细胞的原代培养和鉴定

目的建立一种重复性好、操作简便的成人肾脏足细胞原代培养方法。方法取肾脏肿瘤手术切除后远离患病部位的正常肾脏组织，分离出肾皮质，剪碎研磨并通过差异过筛法分别通过80目（孔径220μm）、40目（450μm）、120目（125μm）细胞筛网，收集120目筛网上肾小球利用植块法进行接种，将接种培养面向上放置，4h后添加培养液并将培养瓶翻转过来正常放置培养箱内孵育。采用形态学观察和细胞间接免疫荧光染色法，对去氧肾上腺素、第八因子（F8）蛋白、波形蛋白、角蛋白和肾母细胞瘤蛋白（WT-1）进行鉴定；并用流式细胞仪分析足细胞纯度。结果接种3d后可见绝大部分肾小球贴壁；5d后几乎全部肾小球贴壁，少许肾小球周围有细胞爬出，体积中等，呈多边形，无突起伸出；7～10d可见所有肾小球周围大量多边形细胞爬出，细胞迅速生长至融合状态，呈铺路石样外观，符合去分化状态足细胞特征；此时胰蛋白酶差异消化去除成纤维细胞传代培养。消化传代后的足细胞胞体、胞核逐渐增大，自细胞体伸出明显树枝状突起，常见双核，符合分化状态足细胞特征。免疫荧光染色发现传代7d后细胞表达足细胞特异性蛋白WT-1、去氧肾上腺素，不表达F8蛋白、波形蛋白、角蛋白，排除内皮细胞、系膜细胞和壁层上皮细胞污染。流式细胞仪分析足细胞纯度为98．3％。结论应用差异过筛法分离人肾小球，并结合植块法进行接种可促进肾小球贴壁，简便、高效地培养出原代足细胞。     

原代培养人胎肝细胞体外感染HBV的研究

目的建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统。方法 首先分离、培养人胎肝细胞,然后应用HBV阳性血清感染体外培养的人胎肝细胞;每隔2d收集上清液和肝细胞,应用ELISA,免疫组化法、原位杂交法和斑点杂交法检测上清液和细胞中HBsAg和HBV DNA。结果 上清液中HBsAg在感染后2d～20d均可测出,以感染后4d～16d达高峰(A值在0．22左右)。免疫组化检测细胞中HBsAg呈阳性表达,原位杂交和斑点杂交检测细胞和上清液中HBV DNA也呈阳性表达。结论 HBV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达16d。     

正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

胃黏膜上皮细胞是进行胃生理功能、病变机制、药物治疗等研究的重要工具，已被广泛应用于科学实验。原代培养细胞能反映原始组织的特点，与体内姊妹细胞的生理状态相似，是进行相关研究的理想材料。但胃黏膜上皮细胞对内环境要求较高，分离纯化后并不象肝细胞等易于存活和生长，不少实验因这一环节而不能进行下去，不得不采用从肿瘤组织衍生的各种细胞株，此类细胞株与正常胃黏膜上皮细胞在生长特性、形态结构等方面存在较大差异，不能代表正常胃黏膜上皮。在我国，几乎所有的相关研究都是采用各种细胞株，因此本文较详细全面地介绍了文献报道中较成功的正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法，以期对相关研究有所帮助。     

湖北钉螺肝脏细胞原代培养的初步研究

目的 研究湖北钉螺肝脏细胞的原代培养方法，观察肝脏细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH） 的活性分布。 方法 解剖湖北钉螺取肝脏，用0.2%（体积比）苯扎溴铵（新洁尔灭）浸泡及含抗生素的生理盐水无菌洗涤、磨碎、过滤，收集肝脏细胞。采用联合法和静置悬浮法接种培养。细胞培养液配方: 50 ml M199溶液、3 mg/ml 水解乳蛋白溶液30 ml(平衡盐溶液配制)及胎牛血清20 ml, 混匀，附加常量抗生素（青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/ml、卡那霉素50 μg/ml），混匀，调节pH值为7.2～7.4。于26.5 ℃ 培养。联合法培养的肝脏细胞分别进行Giemsa、SDH和LDH染色，显微镜观察活细胞与染色细胞形态、SDH和LDH的分布，以及观察静置悬浮法培养的肝脏细胞形态。 结果 联合法培养的肝脏细胞贴壁后形态各异，以圆形、椭圆形为主, 也有三角形和不规则形等。细胞大小约（4～16） μm×（6～20） μm。较小细胞形成细胞簇，细胞核不明显，细胞质丰富、透亮。散在分布的单个细胞稍大，细胞核较大而明显，细胞质较少。培养5～7 d 的肝脏细胞逐渐退化。Giemsa染色将细胞分为两种，一种为细胞质呈蓝色，细胞核紫红色；另一种是细胞质呈紫红色，细胞核呈蓝色。SDH和LDH染色，细胞质出现大小不同、深浅不一的蓝色颗粒。静置悬浮法培养的肝脏细胞不易贴壁，多为圆形，细胞核不明显。细胞较小，约为（4～6） μm×（6～8） μm。培养3 d 均被细菌污染。 结论 联合法更适合湖北钉螺肝脏细胞原代培养，SDH和LDH活性位于肝脏细胞质中。     

分化型血管平滑肌细胞的原代培养

目的 建立大鼠主动脉分化表型血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)原代培养,为研究VSMC表型转化的分子机制提供体外研究模型.方法 无菌条件下分离大鼠胸主动脉中膜,组织贴壁法在Ⅳ型胶原蛋白包被培养瓶内培养大鼠胸主动脉VSMC,消化、过滤、离心,收集从组织块分离的单个细胞后,接种于含0.2%小牛血清、胰岛素样生长因子Ⅰ、DMEM培养液的层粘连蛋白包被的培养板上,培养1天后将培养液更换为不合血清及生长因子的DMEM.结果 根据细胞形态观察、免疫组织化学鉴定、兴奋剂刺激引发的收缩反应、分化型VSMC标志基因的检测,证实为分化型VSMC,分化状态可持续1周以上.结论 在组织贴壁法基础上,改变培养环境,可使VSMC较长时间保持于分化状态,是研究VSMC表型转化的分子机制良好的体外研究模型.     

人肝星状细胞的分离培养方法

HSC是细胞外基质的主要合成细胞。从人肝组织中分离培养HSC,用于中药药理研究,可以得到与人体内相接近的实验结果,从而增加实验数据的可信度。我们成功分离培养了人肝星状细胞（H-HSC）,报道如下。     

乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进

目的 对乳鼠的心肌细胞进行原代培养方法的改进.方法 参照乳鼠心肌细胞原代培养方法,并进行改进,选用混合消化酶(0.08%胰蛋白酶 0.04%～0.06% Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液)及DF培养液进行消化和培养,减少了对心肌细胞的损伤,差速贴壁分离纯化后,加入5-溴-α-脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞分裂增殖.结果 本方法培养的心肌细胞存活率为95.7%,培养2～5 d,视野中绝大多数为已搏动的心肌细胞和心肌细胞团,成纤维细胞无明显增殖.结论 本方法是一种较为理想的乳鼠心肌细胞原代培养方法.     

体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。     

小鼠原代肝细胞的分离与培养

目的探求一种简易、经济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法采用非灌注法分离小鼠肝脏,利用0．2％Ⅳ型胶原酶对肝脏消化以获取肝细胞,以DMEM培养基对肝细胞进行单层培养。结果光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形、类圆形或扁平不规则多角形,排列整齐,细胞界限清晰,胞浆丰富透亮,细胞中有核,有单核、双核是圆形或椭圆形,核仁清晰。结论此方法较适合一般实验室开展小鼠原代肝细胞的分离与培养,为进一步的实验研究提供了基础。     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。