百合基因转化直接分化受体系统的建立

以东方百合(L ilium orien ta l hybrids)“索邦”作为研究材料,通过高频再生系统的建立和抗生素敏感性实验建立了百合稳定高效试管苗小叶离体基因转化的直接分化受体系统.结果表明:鳞片诱导分化培养基以M S+6-BA 1.0 m g.L-1+NAA 0.1 m g.L-1为宜,试管苗小叶柄分化最佳培养基为M S+6-BA 2.0 m g.L-1+NAA 0.3m g.L-1,试管苗鳞片叶分化最佳培养基为M S+6-BA 1.0 m g.L-1+2,4-D 0.3 m g.L-1;确定了试管苗不同部位适宜的抗生素筛选浓度,卡那霉素筛选浓度小叶柄为80 m g.L-1,鳞片叶为120 m g.L-1,羧苄青霉素筛选浓度为300 m g.L-1.     

Anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白靶向结合体外乳腺癌细胞表面受体的研究

为了研究不同表达系统获得的携带绿色荧光抗HER2单链抗体(Anti-HER2-ScFv-GFP)是否既可靶向结合HER2阳性乳腺癌细胞表面,也可通过观察绿色荧光变化直接判断抗体结合乳腺癌细胞表面后细胞的动态变化,在前期成功构建两种表达系统的基础上,利用Ni~(2+)-NTA亲和层析法纯化来源于真核表达系统pFAST Bac to Bac HT A/Tn-5B1-4和原核表达系统pBAD His B/TOP10的融合蛋白Anti-HER2-ScFv-GFP,设置HER2阳性细胞SKBR3为实验组、HER2阴性细胞MCF7为对照组,分别与之混合24 h后,1×PBS洗脱细胞3次,激光共聚焦显微镜观察到两种不同表达系统获得的融合蛋白在HER2阳性细胞SKBR3表面分布均有绿色荧光,真核表达的蛋白结合效率明显高于原核表达的蛋白,SKBR3结合高浓度的融合蛋白后细胞表现出皱缩,绿色荧光明显增强,而两种不同来源的融合蛋白与HER2阴性MCF7混合后均易被洗脱。GFP标准品与SKBR3混合后也容易被洗脱。实验表明构建的携带绿色荧光抗HER2单链抗体同时具有靶向结合和报告作用两方面的功能。     

半乳糖配体介导大鼠白介素10基因在大鼠肝脏内的靶向表达

目的 探讨大鼠白介素10（rIL-10）基因是否可通过半乳糖配体介导的脂质体转染法在大鼠肝脏内靶向表达。方法将已构建好的rIL-10基因真核表达质粒与半乳糖配体转染试剂按jetPEI．Gal／DNA（N／P=10）比例混合,通过尾静脉注射转移至大鼠体内。RT—PCR法和ELISA法检测rIL-10基因转移至体内0h、24h、7d和16d后大鼠肝、肾、脾和肺组织及血清中rIL-10的表达情况。结果rIL-10基因转移前大鼠肝、肾、脾和肺组织末扩增出明显rIL-10mRNA表达,转移7d后rIL-10表达主要分布在肝组织。肝组织中rIL-10mRNA表达在基因转移24h和7d时显著升高。血清中的rIL-10浓度在转移后24h和7d浓度分别为（107．92±12．26）pg／ml和（33．2±13．15）pg／ml。结论rIL-10基因通过半乳糖配体介导的脂质体转染法可有效的转移至大鼠体内,并可在肝脏靶向表达一周左右时间。     

一种新的趋化因子诱饵受体CCX-CKR

与Duffy抗原趋化因子受体(DARC) 和D6一样,CCX-CKR也是一个具有7次跨膜结构,但却不与G 蛋白偶联,也不激活细胞内信号转导系统的趋化因子诱饵受体. CCX-CKR独特的趋化因子结合谱及与人类疾病的关系引起了人们极大的兴趣.     

基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术

遗传性变异是表型多样性的基础,靶向饱和突变作物基因可以促进产生具有优异农艺性状的突变体。相较于传统诱变育种和异源物种中的定向进化方法,基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术可对植物内源基因产生高效突变,从而实现原位定向进化,加快植物育种及功能基因研究进程。该文介绍了使用饱和靶向内源基因突变编辑器(STEME)对植...     

透明质酸介导的细胞游走受体基因的分子生物学特性及其与肿瘤的关系

透明质酸介导的细胞游走受体（receptor for hyaluronan—mediated motility,RHAMM）是继CIM4之后发现的,分布于细胞膜表面、细胞浆以及细胞核,参与细胞分裂周期的调节、细胞的生长增殖、细胞迁移运动、细胞骨架的组装以及维持中心体和纺锤体极的结构的完整性,与细胞恶性转化、肿瘤浸润和转移等生物学行为密切相关;并且已作为一些肿瘤的肿瘤相关抗原,确定了其抗原表位,成为肿瘤免疫治疗的靶点;在一些肿瘤组织内的表达水平升高和呈现一定的表达模式,与肿瘤临床分级以及肿瘤预后有一定的相关性。     

一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定

艾滋病病毒 (Human immunodeficiency virus,HIV) 通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞 (DC) 清除研究奠定了基础。     

靶向RNA的CRISPR-Cas系统研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated proteins)系统是细菌和古细菌抵抗噬菌体、质粒等外源遗传物质的一种适应性免疫系统,该系统利用一种特殊的RNA(CRISPR RNA,crRNA)指导的内切酶来切割与crRNA相互补的外源遗传物质,从而阻碍外源核酸的侵染。根据效应复合物组成形式的不同,CRISPR-Cas系统分为1类(Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅲ型)和2类(Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)两大类。目前已发现多个CRISPR-Cas系统具有非常强的特异靶向RNA编辑能力,如Ⅵ型CRISPR-Cas13系统和Ⅲ型CRISPR-Cas7-11系统。随着研究的深入,相关系统在RNA编辑领域应用日渐广泛,使其成为基因编辑的有力工具。本文介绍了靶向RNA的CRISPR-Cas系统的组成、结构、分子机制以及其潜在应用,这为更好地研究该类系统的作用机制奠定基础,也为后期开发为稳定的基因编辑工具提供新的思路。     

一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响

腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡．E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡,前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMVIE启动子下游．构建成转移载体pCAE1A。采用lipofectin法将PCAE1A和含腺病毒基因组（E1、E3区缺失）的质粒pBHG11共转染293细胞,7～10d后得到重组病毒v5Ad4。用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549,结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能。在人胚肺正常二倍体细胞中,v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应。     

一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响

腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡,E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡,前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游,构建成转移载体pCAE1A.采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞,7～10 d后得到重组病毒v5Ad4.用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549,结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能.在人胚肺正常二倍体细胞中,v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应.     

一种有效的嗜热真菌杜邦嗜热菌靶向基因替代系统

以嗜热真菌杜邦嗜热菌Thermomyces dupontii NRRL 2155为研究材料,利用同源重组原理和真菌原生质体转化方法,以潮霉素抗性基因替换嗜热真菌目标基因,获得抗潮霉素的靶向基因敲除突变菌株。优化的遗传转化体系为：用15mg/mL裂解酶,在28℃下酶解2g杜邦嗜热菌菌丝5.5h以获得原生质体,经STC缓冲液洗涤重悬后,利用PEG（polyethylene glycol）介导的遗传转化方式,将10μg线性敲除全长片段转化至杜邦嗜热菌原生质体中,通过潮霉素筛选及PCR验证得到基因替换突变菌株,同源重组率达到20%。本研究首次将原生质体转化方法应用在杜邦嗜热菌,并成功建立稳定高效的基因替换体系,为快速构建杜邦嗜热菌的遗传转化体系和研究该嗜热真菌的基因功能提供有效方法。     

以ErbB受体为靶向的融合蛋白抗肿瘤治疗研究进展

ErbB受体介导的信号转导途径对外胚层来源的肿瘤的增殖、浸润、转移、及血管新生起促进作用。因此,出现了针对ErbB受体信号转导途径各环节的不同的抗肿瘤治疗策略,包括抗ErbB受体的单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂等,而ErbB受体介导的融合蛋白因其高选择性引起人们的重视。主要探讨了具有抗肿瘤作用的以ErbB受体介导的融合蛋白在组成和细胞毒性方面的研究进展。     

用酵母双杂交系统分离一个新的人类细胞凋亡诱发基因

asy基因是最近发现的一个新的凋亡诱发基因, 但其诱发凋亡的机制仍不清楚. 采用酵母双杂交系统, 从人肺细胞系(WI-38)cDNA文库中克隆了一个asy相互作用蛋白基因asyip (asy interacting protein). asyip在人的各种组织内均能组成型转录合成1.8和2.7 kb两种mRNA转录本, 但转录水平有明显差异, 在脑组织中转录水平最高. 而且, 脑组织中2.7 kbmRNA转录水平大大高于1.8 kb的转录本. 序列分析表明两种转录本起始于一个共同的5′端,但3′端加poly(A)位点不同. 两者共享一个大的可读框, 编码26 ku的蛋白ASYIP. 推论的氨基酸一级结构表明, ASYIP含有两个大的强疏水区、两个蛋白激酶C磷酸化位点和两个酪蛋白激酶磷酸化位点. C端具有一个内质网捕获信号(Lys-Lys-Lys-Ala-Glu). 免疫沉淀试验进一步验证ASYIP和ASY在哺乳动物细胞中可以相互结合. 与asy基因一样, asyip基因的大量表达能抑制肿瘤细胞Saos-2的生长, 诱发细胞凋亡, 但效率比asy低.     

用微弹轰击法将GUS基因导入小麦的完整细胞

微弹轰击法将外源DNA导入小麦(Triticum,aestivum)未成熟胚和悬浮细胞系的完整细胞。用pCI GUS作报告基因,质粒DNA涂于钨粉微弹表层,用基因枪轰击使微弹穿透细胞壁进入小麦细胞。处理2天后,用x—glucuronide染色,对GUS基因产物的活性进行鉴定,GUS基因表达的细胞呈深蓝色的小点。小麦幼胚表面的蓝点最多可达40～50个,悬浮细胞系中GUS基因表达的细胞较少。试验表明微弹轰击法是小麦组织水平上进行外源基因导入的一个有效途径。试验对微弹轰击的有关参数及条件进行了讨论。     

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用.为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP.以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达.初步检测结果显示在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率＞90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率＜30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体.     

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用。为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP。以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达。初步检测结果显示:在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率>90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率<30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体。     

中国人群5—羟色胺2A受体基因中T102C多态性与精神分裂症的联系

在研究５－羟色胺２Ａ受体基因多态性与精神分裂症的关联分析中,调查了２０２例精神分裂症患者及２０２例正常对照。各相匹配组间比较未发现基因型和等位基因频率的显著性差异。结果提示,在中国人群中５－羟色胺２Ａ受体的静态Ｔ１０２Ｃ突变与精神分裂症之间不存在关联。     

KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

aAd-p53基因靶向治疗癌性胸腹水的临床效果分析

目的:探讨aAd-p53注射液靶向灌注治疗癌性胸腹水的临床疗效和安全性。方法:选择2012年5月-2014年2月在我院接受治疗的癌性胸腹水患者80例,根据治疗方法的不同,将患者随机分为研究组和对照组,每组40例。研究组患者采用腔内灌注rAd-p53治疗,对照组患者采用表阿霉素灌注治疗,观察并比较两组患者的治疗总有效率、不良反应的发生率及KPS功能评分的变化情况。结果:所有患者均顺利完成灌注治疗,病情获得好转,生存质量得到改善。研究组和对照组的治疗总有效率分别为70%、67.5%,两组比较无显著性差异(P0.05)。两组治疗后KPS评分均显著高于治疗前,且研究组高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。研究组和对照组不良反应的发生率分别为20%和25%,研究组低于对照组,但两组差异并无统计学意义(P0.05)。结论:rAd-p53注射液靶向灌注治疗是一种治疗癌性胸腹水安全有效的方法,值得临床推广。     

利用靶向表皮生长因子受体的磁性纳米载体进行肝癌细胞基因治疗的效果观察

目的本研究采用靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体对磁性纳米基因载体颗粒进行靶向修饰后进行针对肝癌的基因治疗,观察其对肝癌细胞HepG2的基因治疗效果。方法制备靶向EGFR的SPIO磁性纳米基因载体。对肝癌细胞HepG2进行EGFR免疫荧光染色证明其在细胞膜上的表达。以Lipofectamine~(TM) 2000推荐质粒用量的1/20进行分组转染,EGFR-Ab-Poly MAG100基因载体组作为(EP)组;Lipofectamine~(TM) 2000基因载体组作为(LF)组;未转染空白对照细胞作为(NC)组。荧光显微镜观察纳米造影剂的细胞内吞效果。荧光实时定量PCR检测目的基因mRNA表达。western blot法进行蛋白表达鉴定。四甲基偶氮唑盐法检测基因治疗效果。HCCR-2 mRNA、HCCR-2蛋白和Ki67蛋白表达水平数据、A值的比较采用单因素方差分析和t检验。结果免疫荧光法染色观察发现,肝癌HepG2细胞膜高表达EGFR蛋白。磁性纳米基因载体有效链接EGFR抗体。EP组细胞中质粒大量进入HepG2细胞,质粒内吞量大于LF组和NC组。EP组HCCR2 mRNA的相对表达量为(11.25±0.23)%,相对表达量明显低于NC组,差异具有统计学意义(t=23.57,P=0.00)。EP组HCCR2蛋白的相对表达量为(0.13±0.02),明显低于NC组的0.62±0.05,差异具有统计学意义(t=29.31,P=0.00)。EP组Ki67蛋白的相对表达量为(0.22±0.04),明显低于NC组的(0.83±0.07),差异具有统计学意义(t=18.88,P=0.00)。转染24 h、48 h后,EP组的A值明显低于NC组,差异具有统计学意义(t=-22.02,-34.73,P=0.00,0.00)。结论采用EGFR单克隆抗体修饰后的磁性纳米基因载体颗粒,可以实现对肝癌细胞的高效基因治疗,进而实现对肝癌细胞的增殖抑制。