华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。     

天冬氨酸转氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

为寻找根瘤菌中与共生固氮相关的调控基因,采用同源重组法,分别敲除中慢生根瘤菌MAFF303099在与豆科植物百脉根共生固氮过程上调表达的10个基因,研究它们对共生固氮的影响。结果显示:Δmlr5883敲除突变体相比于野生型MAFF303099,其固氮酶活性下降40%,侵染细胞形态未发生显著改变,对Δmlr5883回补可恢复固氮酶活性;预测mlr5883编码天冬氨酸氨基转移酶,体外检测该酶的天冬氨酸转氨酶活性为16.67 U/mg。该基因的突变会影响固氮效率,推测其可能参与对植物供给碳源的代谢过程。     

华癸中慢生根瘤菌焦磷酸硫胺素结合蛋白基因tpp的功能研究

在构建M.huakuii tpp基因突变株的基础上,通过自生生长和植物盆栽试验,研究焦磷酸硫胺素结合蛋白tpp基因在根瘤菌的生长及与紫云英宿主共生固氮过程中的功能。通过同源重组获得华癸中慢生根瘤菌tpp突变菌株HKtpp,并进一步研究tpp基因突变对菌株生长及共生固氮功能的影响。结果显示:tpp基因突变会减缓菌株生长,突变菌株胞内的谷胱甘肽还原酶活性显著降低。植物盆栽试验表明,突变菌株感染紫云英宿主形成有效的红色根瘤,但是其固氮酶活降低了26.4%。结果表明:tpp基因在根瘤菌的生长和共生固氮中发挥着重要作用。     

慢生根瘤菌及其与花生共生机制研究进展

氮是植物生长发育所必需的大量元素之一,豆科植物通过与根瘤菌的共生固氮获得氮素.这种共生关系的建立包括结瘤和固氮两个过程,涉及复杂的互作调控机理,并受环境因素的显著影响.花生与慢生根瘤菌的共生对花生生产尤为重要,具有较多特异和未知的共生机制.本文综述了慢生根瘤菌及其与花生共生的相关内容,具体包括:(1)花生的慢生根瘤菌多...     

苜蓿中华根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定

为了阐明豆科植物共生反应与免疫反应的协调机制,揭示参与植物细胞侵染、定殖及固氮过程中根瘤菌基因的功能,以苜蓿中华根瘤菌Sm2011为材料,构建了约8 000株Tn5-sacB转座子插入的突变体库。利用巢式PCR检测技术,从中鉴定和筛选出nodC、nifH、smc01188和smc04024等4个特定目标基因的插入突变体及其插入位点。通过结瘤试验考察突变体共生及固氮表型,结果显示:植株接种smc01188突变体28d后,与对照植株相比,该基因突变导致根瘤固氮酶活下降,与慢生型大豆根瘤菌该基因突变体的表型类似;smc04024基因突变不影响植株生长,根瘤发育基本正常;接种nifH突变体后,植株呈缺氮表型,生长发育受阻,根瘤为白色;接种nodC突变体后植株不结瘤,说明Tn5-SacB的插入导致nifH、nodC基因功能丧失。利用PCR检测、鉴定和分离目标基因突变体是一种行之有效的方法。     

解磷菌和根瘤菌复合接种对大豆和紫云英共生固氮的影响

从大豆根际及根瘤中分离获得2株具有较高解磷能力的细菌PSB-1和HZP1,通过Salkowski比色法和钼锑钪比色法,对这2个菌株产生IAA(indole-3-acetic acid,IAA)的能力和溶解无机磷的能力进行了测定,同时对紫云英和大豆进行接种,并对田间栽培的大豆进行了菌剂接种试验。结果显示:PSB-1及HZP1均具有解磷及产IAA的特性;单接种解磷菌HZP1或PSB-1均有促进紫云英和大豆生长的作用;相比于单接种根瘤菌,将这2株解磷细菌分别与根瘤菌混合接种能进一步提高大豆和紫云英的地上生物量、根瘤鲜质量和根瘤数。田间试验结果显示,单独接种根瘤菌剂或解磷菌剂都有一定的增产效果,但双接种根瘤菌剂和解磷菌剂的增产效果不明显。     

豌豆根瘤菌ohrB基因的抗氧化和共生固氮表型

采用基因敲除构建豌豆根瘤菌ohr B基因突变株,研究突变株的抗氧化和共生固氮表型。结果表明:ohr B基因不影响菌株在自生培养条件下的生长能力,但对氢过氧化枯烯(cumene hydroperoxyde,Cu OOH)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸钠(Na Cl O)等氧化物敏感,且在Cu OOH胁迫下,相比野生型菌株,突变株的存活率显著下降。荧光定量RT-PCR结果显示,豌豆根瘤菌ohr B基因表达不受H2O2诱导,且ohr B基因的缺失对其他抗氧化基因的表达没有影响。共生实验表明,ohr B基因对根瘤菌共生固氮能力及根际定殖能力没有影响,但在7 d瘤龄的豌豆根瘤类菌体中表达水平显著提高,并对根瘤菌结瘤能力有影响。ohr B基因虽对豌豆根瘤菌的自生生长、共生固氮、根圈定殖没有影响,但在抗氧化及竞争结瘤中发挥重要作用。     

外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响

 将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI、含紫云英根瘤菌共生基因的重组质粒pRaZ15及含苜蓿根瘤菌共生基因的重组质粒pRmSL26导入紫云英根瘤菌野生型菌株7653R，然后对3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定。结果表明：转移接合子7653R（pJB5JI）的共生固氮能力较出发菌株7653R大幅度提高，而且表现出较高的竞争结瘤能力，转移接合子7653R（pRmSL26）在固氮酶活性、植物干重及结瘤数方面亦显著高于对照菌株7653R；转移接合子7653R（pRaZ15）虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现显著性差异，但结瘤数显著减少。     

4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响

在室内条件下,研究了乙羧氟草醚、三氟羧草醚、乙草胺和异丙甲草胺等4种除草剂对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮的影响。结果表明:4种除草剂均能对紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮产生一定的抑制作用,其中以乙羧氟草醚的抑制作用最强,在高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为68.5%,70.6%,与对照植株的结瘤率和总含氮量92%和2.620%相比,其结瘤率和总含氮量为31%和0.072%;异丙甲草胺的抑制作用最弱,高剂量下鲜重抑制率和干重抑制率分别为18.5%和26.8%,与对照植株的结瘤率和总含氮量94%和2.136%相比,其结瘤率和总含氮量为60%及0.482%;紫花苜蓿经四种除草剂不同剂量处理后,总含氮量远远低于对照植株的总含氮量。     

类枯草杆菌蛋白酶基因GmSBT1在大豆共生固氮中的功能

为研究SBT（subtilases）家族蛋白在豆科植物共生固氮中的作用机制,分别利用生物信息学分析、时空表达定位、GUS 染色定位和基因沉默等方法来研究GmSBT1在大豆-根瘤菌共生中的作用。结果显示：GmSBT1受根瘤菌特异性诱导,在成熟根瘤中高量表达,且在根瘤皮层以及含菌细胞中发挥功能。GmSBT1-RNAi植株地上鲜质量、瘤质量、固氮酶活显著降低。结果表明 ,GmSBT1 蛋白对根瘤的形成和发育以及根瘤的固氮具有重要的作用。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

副溶血性弧菌vtrB基因敲除菌株的构建及其在抵抗胆汁中的作用

构建副溶血性弧菌转录调节因子VtrB （V.parahaemolyticus T3SS2 regulator B）敲除菌株和回补菌株,探讨VtrB在副溶血性弧菌抵抗胆汁中的作用。根据GenBank数据库中副溶血性弧菌vtrB基因上下游序列设计引物,通过融合PCR将vtrB基因上下游同源臂融合并克隆入自杀质粒pDS132中,将重组自杀质粒转入大肠杆菌S17-1 λpir中,再接合转移至副溶血性弧菌中进行同源重组,通过10%蔗糖筛选获得vtrB基因突变株ΔvtrB。将pBAD33-vtrB重组质粒电转入ΔvtrB突变株中获得回补菌株C-ΔvtrB。研究副溶血性弧菌野生型、突变株和回补株在2%脱氧胆酸盐（DOC）处理后的存活率。基于同源重组原理,经vtrB基因的PCR扩增和转录水平检测结果表明,成功获得副溶血性弧菌vtrB基因缺失突变株ΔvtrB和回补株C-ΔvtrB。与野生型和回补菌株C-ΔvtrB相比,ΔvtrB突变株在2% DOC处理20、40和60 min后的存活率分别为17%、4%和1%,vtrB基因的失活使得副溶血性弧菌对胆汁抵抗能力极显著降低（P<0.001）,表现出存活能力的缺陷。由此表明,转录调节因子VtrB有助于副溶血性弧菌对胆汁的抵抗。     

紫云英翻压条件下生物炭基肥配施量对水稻Cd迁移累积的影响

为探究翻压紫云英条件下,生物炭基肥配施量对水稻生长发育和水稻各器官Cd迁移积累的影响。通过盆栽试验,设置5个处理：紫云英替代30%的氮肥+70%氮肥（FNG30,对照）、30%紫云英+10%生物炭基肥+60%氮肥（FNG30B10）、30%紫云英+20%生物炭基肥+50%氮肥（FNG30B20）、30%紫云英+30%生物炭基肥+40%氮肥（FNG30B30）、30%紫云英+40%生物炭基肥+30%氮肥（FNG30B40）,研究不同生物炭基肥配施量对早稻生长发育和水稻Cd迁移累积的影响。结果表明：与对照相比,生物炭基肥配施处理均能提高水稻籽粒的产量,且水稻籽粒产量随生物炭基肥配施量的增加而提高;生物炭基肥的配施可降低水稻糙米中的Cd含量,与对照相比,生物炭基肥配施后各处理降幅大小为FNG30B30（29.2%） > FNG30B20（20.8%） > FNG30B40（19.6%） > FNG30B10（8.3%）;生物炭基肥可抑制Cd从水稻根向地上部位的转运,在30%的生物炭基肥配施处理时抑制效果最为明显,且Cd从谷壳到糙米的转运能力最低。综上,在翻压紫云英条件下,配施生物炭基肥能有效降低水稻Cd污染风险,且30%的生物炭基肥配施量时降低稻田Cd污染风险效果最佳。     

异源过表达蒺藜苜蓿MtATG7基因促进拟南芥抵抗碳氮饥饿胁迫

【目的】真核生物通过保守的自噬途径降解错误折叠的蛋白质或受损细胞器,实现对营养物质的循环再利用。本文旨在解析苜蓿自噬基因在植物应对营养胁迫中发挥的功能,为指导苜蓿的选育和改良提供参考。【方法】以自噬途径的关键限速基因ATG7(Autophagy-related gene 7)为切入点,分析ATG7氨基酸序列在不同植物中的相似性。利用蒺藜苜蓿Medicago truncatula的MtATG7基因过表达载体转化拟南芥植株,获得异源过表达植株35S::MtATG7和互补拟南芥突变体的atg7/35S::MtATG7植株,并对其抗胁迫表型和自噬活性进行分析。【结果】在碳饥饿条件下,atg7/35S::MtATG7能够挽救atg7突变体叶片早衰的表型;恢复到正常生长条件以后,35S::MtATG7和atg7/35S::MtATG7植株存活率和野生型相比都显著提高。GFP-ATG8e的剪切试验表明,atg7/35S::MtATG7能够恢复atg7突变体的自噬降解活性。在氮饥饿条件下过表达MtATG7同样能够减缓拟南芥叶片的衰老速度。【结论】异源过表达MtATG7能增强拟南芥碳氮饥饿抗性的生物学功...     

羊草与克氏针茅氮元素含量对亚洲小车蝗取食选择的影响

选择2种内蒙古草原的优势草种羊草和克式针茅,通过人工饲喂蝗虫取食的方法,分别测定亚洲小车蝗的5龄蝻期以及成虫在未施肥(ON)和施肥(HN)条件下对于2种不同草种的取食量和选择频次,并研究N元素变化对于亚洲小车蝗取食选择性的影响。结果表明,在蝻期,N元素不是其取食选择性和食量的决定因素。而在成虫期,亚洲小车蝗特别是雄性更喜欢低N植物作为其食物。亚洲小车蝗对羊草或针茅的选择取食随发育阶段、性别和草的N含量进行调整,但在进化过程中趋向于选择低氮的植物。     

金鱼Dmrt2基因表达分析

采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼(Carassius auratus)不同发育时期以及不同组织中的表达情况,用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2a cDNA序列的全长为1 755 bp,5’和3’非编码区长分别为188 bp和67 bp,推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支,与斑马鱼(Daniorerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示,Dmrt2a在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而Dmrt2b在卵巢中表达量最高,在精巢中次之,二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达,但表达量低;不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量变化很大,Dmrt2a在受精后24 h达到最高值,之后表达量降低,而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。