低频脉冲电磁场通过 PC2/sAC/PKA/CREB 信号途径促进大鼠颅骨成骨细胞的矿化和成熟

目的 研究低频脉冲电磁场（PEMFs）促进成骨细胞矿化成熟作用是否与初级纤毛及定位于初级纤毛的多囊蛋白2（PC2）和sAC/PKA/CREB信号通路有关。方法 检测新生大鼠颅骨成骨细胞（ROBs）经50 Hz 0.6 mT PEMFs分别处理0、5、15、30、60、90、120 min后PC2、sAC、PKA、CREB及其磷酸化蛋白的表达水平;用盐酸阿米洛利阻断PC2功能,检测sAC/PKA/CREB信号通路活性变化及ROBs矿化成熟是否受到影响;用RNA干扰法敲低PC2表达水平后做同上检查;用免疫荧光染色法观察PC2、sAC、PKA、CREB及其磷酸化蛋白与初级纤毛的共定位情况;用RNA干扰法抑制初级纤毛发生后检测PC2和sAC/PKA/CREB信号途径相关蛋白的表达情况。结果 ROBs经PEMFs处理0、5、15、30、60、90、120 min后,PC2、sAC、p-PKA和 p-CREB表达水平均增加（P<0.01）。阻断PC2功能或敲低PC2表达水平后,sAC/PKA/CREB信号通路未被激活,成骨细胞的矿化成熟受阻（P<0.01）。PC2、sAC、p-PKA和 p-CREB可被定位于整根初级纤毛或其根部,但PKA和CREB在初级纤毛内没有分布。干扰初级纤毛后,PEMFs处理未提高PC2表达量（P<0.01）,未激活sAC/PKA/CREB信号通路,也不再能促进成骨细胞矿化成熟。结论 存在于ROBs初级纤毛表面的PC2可感知并传递PEMFs发出的物理信号,通过激活PC2/sAC/PKA/CREB信号途径促进成骨细胞的矿化成熟。     

初级纤毛的若干研究进展

初级纤毛是近年来生物医学领域的一个研究热点.它是一种广泛存在于各种细胞表面的细胞器,体形微小但结构复杂,作用强大,具有重要的感官作用,能感知细胞外机械和化学信号变化并协助其转导至细胞内部,从而引起细胞应答.近年发现Hedgehog、Wnt等多种发育信号通路的运行和调控依赖于初级纤毛,决定了它在人体许多组织和器官的发育成形及正常生理活动中扮演重要角色,同时也决定了其结构和功能的异常导致多种纤毛相关疾病的发生,包括一些遗传病和肿瘤等.随着免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察等新实验方法的应用,人们对初级纤毛有了更深入的了解,为进一步指导纤毛相关疾病的干预诊疗奠定了基础.     

咖啡因在帕金森病小鼠模型中神经保护作用的转录组学分析

目的：通过转录组学分析探讨咖啡因对帕金森病认知功能（工作记忆）保护作用的可能分子机制。方法：采取脑立体定位注射的方式，在小鼠双侧海马脑区注射α-突触核蛋白（α-Syn）纤维体并给予咖啡因喂养。3个月后取小鼠海马组织进行转录组测序（RNA-seq）分析。结果：α-Syn在海马脑区明显聚集且小鼠表现出工作记忆能力受损（P＜0.05）；咖啡因可有效改善α-Syn诱导的小鼠认知障碍（P＜0.05）；α-Syn造模后的转录组变化主要富集在小胶质细胞激活及趋化招募等信号通路；而长期饮用咖啡因可显著增强细胞的增殖能力（P＜0.05）。结论：咖啡因可能是通过促进细胞增殖来修复α-Syn引起的神经炎症损伤。     

促黑素促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化中cAMP的作用

目的： 探讨骨胳肌细胞中环磷酸腺苷（cAMP）对脂肪酸氧化的影响,阐明促黑素（α-MSH）对脂肪酸氧化影响的作用机制。方法：采用α-MSH、cAMP类似物Bt2cAMP、8-BrcAMP和cAMP拮抗剂分别处理体外培养的原代骨骼肌细胞(PMC)和C2C12成肌细胞,分为α-MSH组、cAMP类似物组、cAMP拮抗剂加α-MSH组,同时设正常对照组,利用（9,10-3H）棕榈酸生成3H2O的方法测定脂肪酸氧化。RT-PCR法测定PMC和C2C12成肌细胞黑皮质素受体（MCR）的表达。结果：α-MSH组和cAMP类似物组与对照组比较脂肪酸氧化显著增加（P<0.05）;cAMP拮抗剂RpcAMP预处理组细胞脂肪酸氧化率明显降低,与对照组比较差异无显著性（P>0.05）,与α-MSH组比较差异有显著性（P<0.05）。结论： α-MSH和cAMP类似物显著增加了脂肪酸氧化,α-MSH可能与MCR结合通过cAMP信号传导通路促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化。     

初级纤毛对骨骼发育的影响

随着常染色体显性多囊肾病“初级纤毛学说”研究的深入,多囊蛋白-初级纤毛复合体在骨骼发育过程中的重要作用越来越受到人们的关注。多囊蛋白-初级纤毛复合体结构和功能的异常,可导致膜内成骨和软骨内成骨的延迟,且可出现骨质疏松、隐性脊柱裂和软骨发育不良等多种并发症。研究发现骨细胞-成骨细胞表面的初级纤毛作为一种机械感受器,具有多种激素受体和压力门控离子通道,可感受外界应力作用,调节细胞内离子浓度及信号传导通路,从而维持骨的正常发育。本文就多囊蛋白-初级纤毛复合体对骨骼发育影响及其分子机制进行了综述。     

初级纤毛及Hedgehog信号通路在银屑病角质形成细胞增殖过程中的作用

目的:探讨初级纤毛相关基因及Hedgehog(Hh)信号通路在角质形成细胞(KC)增殖过程中的作用,寻找治疗银屑病的特异性靶向治疗途径。方法:体外培养HaCaT细胞(人永生化表皮细胞系),并通过肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导HaCaT细胞过度增殖,从而在体外模拟银屑病KC的增殖状态。构建纤毛生成必需基因Ift88特异性siRNA表达载体,体外转染TNF-α诱导的过度增殖HaCaT细胞,24 h后扫描电镜观察KC表面的纤毛生长情况,检测纤毛相关基因和Hh通路中Ptch-1和Gli-1的蛋白表达水平,并观察细胞的增殖情况。结果:TNF-α诱导的过度增殖的HaCaT细胞表达的初级纤毛较多,纤毛相关基因和Hh通路中Ptch-1和Gli-1均高表达。抑制Ift88基因表达能够有效减少具有初级纤毛的细胞比例,并且下调Ptch-1和Gli-1的表达,HaCaT细胞的增殖也受到明显抑制。结论:抑制纤毛的形成能够阻断Hh信号通路,从而抑制KC的过度增殖;初级纤毛可能参与了银屑病的发生,通过激活Hh信号通路促进银屑病的发生和发展。     

初级纤毛的功能及其在心血管系统中的作用

初级纤毛作为一个独立细胞元件,广泛分布于各类非增殖细胞表面,其生命周期始于静止,在有丝分裂前结束。虽然初级纤毛的结构微小只能通过电镜观察,但却具有感知机械、流体、光及化学信号等强大功能。当其结构和功能发生障碍时,会导致一系列纤毛相关疾病,涉及成骨、肾脏、心脏等器官和领域。在心脏发育、维持心血管系统的正常节律和病变过程中,初级纤毛通过调节一系列信号通路扮演重要角色,是心血管系统对应激做出适应性调节、维持稳态的关键感受器。未来,通过对初级纤毛功能及调控机制的研究,将为纤毛疾病的防治提供理论依据。     

α5-烟碱型乙酰胆碱受体表达下调对肺癌细胞HIF-1α表达的影响

目的 通过下调α5-烟碱型乙酰胆碱受体（α5-nAChR）的表达,体外研究尼古丁促肺癌细胞增殖过程中α5-nAChR对缺氧诱导因子（HIF-1α）表达的影响。方法 以不同浓度尼古丁作用人肺腺癌细胞株A549,分别采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测A549细胞中α5-nAChR、HIF-1α mRNA和蛋白的表达。MTT法、实时荧光定量PCR、Western blotting检测CHRNA5-siRNA转染后,尼古丁促A549细胞增殖的作用和HIF-1α表达的变化。结果 尼古丁浓度为1μmol/L时,α5-nAChR和HIF-1α表达明显升高（P<0.05）,二者表达呈尼古丁浓度依赖性。CHRNA5-siRNA转染显著抑制α5-nAChR、HIF-1α表达（P<0.05）,尼古丁促A549细胞增殖的作用明显受到抑制（P<0.05）。结论 α5-nAchR通过调节HIF-1α的表达,在尼古丁促肺癌细胞增殖中起作用,提示α5-nAChR/HIF-1α信号轴可能是吸烟相关性肺癌发生的重要分子机制之一。     

rL-RVG通过拮抗α7烟碱型乙酰胆碱受体影响胃癌细胞凋亡及增殖

目的: 探讨表达狂犬病毒糖蛋白（RVG）的重组LaSota株新城疫病毒（recombinant LaSota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein,rL RVG）是否通过α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR）影响胃癌细胞HGC的增殖与凋亡。方法: 将rL RVG、新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）和PBS分别感染胃癌HGC细胞24 h后,采用蛋白质印迹法检测RVG、NDV、pro caspase 3蛋白和α7 nAChR在HGC细胞中的表达,免疫荧光检测α7 nAChR在HGC细胞中的表达,MTT检测HGC细胞的增殖情况。将HGC细胞随机分为rL RVG组、rL RVG+α7 nAChR抑制剂组、rL RVG+α7 nAChR 激动剂组,NDV组、NDV+α7 nAChR抑制剂组、NDV+α7 nAChR激动剂组,PBS组、PBS+α7 nAChR抑制剂组、PBS+α7 nAChR 激动剂组;倒置显微镜下观察各组细胞形态,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白pro caspase 3、bax、bcl 2表达水平。结果： 蛋白质印迹结果显示,病毒感染HGC细胞24 h后,NDV、pro caspase 3蛋白和α7 nAChR在rL RVG组、NDV组的表达均显著高于PBS组（P均<0.01）,RVG蛋白在rL RVG组表达显著高于NDV组和PBS组（P均<0.01）;免疫荧光显示α7 nAChR在rL RVG组中明显高于NDV组和PBS组。MTT结果显示两种病毒浓度大于10-5mmol/L 对细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05)。倒置显微镜下可见NDV+α7 nAChR抑制剂组、PBS+α7 nAChR抑制剂组HGC细胞分别较NDV组、PBS组皱缩、凋亡更明显,但rL RVG组与其α7 nAChR抑制剂组相比细胞皱缩、凋亡差异不明显;rL RVG+α7 nAChR激动剂组、NDV+α7 nAChR激动剂组、PBS+α7 nAChR激动剂组HGC细胞皱缩、凋亡分别较rL RVG组、NDV组、PBS组明显减弱。蛋白质印迹显示bcl 2、bax和pro caspase 3蛋白在rL RVG+α7 nAChR抑制剂组的相对表达量与rL RVG组无显著性差异（P均>0.05）,但在NDV+α7 nAChR抑制剂组、PBS+α7 nAChR抑制剂组的相对表达量分别较NDV组、PBS组显著上调(P均<0.01);rL RVG+α7 nAChR 激动剂组、NDV+α7 nAChR激动剂组、PBS+α7 nAChR 激动剂组的bax、pro caspase 3蛋白相对表达量分别较rL RVG组、NDV组和PBS组明显下调（P均<0.01）,bcl 2蛋白相对表达量则明显上调（P均<0.01）。 结论： rL RVG感染HGC后稳定表达,可能通过拮抗α7 nAChR途径促进胃癌细胞的凋亡和抑制其增殖。     

纤毛在心脏发育和先天性心脏病中的作用及机制

纤毛是细胞表面的突起状细胞结构,几乎存在于每一类细胞。根据微管蛋白的组成结构及数量的不同,可以将纤毛分为运动纤毛和感觉纤毛两类,其中感觉纤毛又称非运动纤毛和初级纤毛。纤毛与内脏器官的发育及许多人体生理活动密切相关,已有研究证明,纤毛参与调控心脏左右房室结构的形成过程,并最终使心脏发育为不完全对称的左右房室腔。而先天性心脏疾病(CHD)是一类以心腔与流出道空间结构发育异常为特征的疾病,因此,纤毛在CHD的发病机制中起重要作用。心脏左右不对称结构的形成、细胞的极性及迁移均受纤毛调控,并主要通过纤毛转导信号通路来实现,明确纤毛转导信号通路对心脏发育的调控机制,可以为CHD的临床治疗提供新靶点和新思路,同时为CHD的产前筛查提供新的检测基因。本文总结了纤毛在心脏发育及CHD中作用及机制的最新研究进展。     

原纤毛及其在肿瘤发生发展中的作用

原纤毛是一个突出于大多数真核细胞表面的感觉细胞器,其重要功能是接收和转导细胞内外各种关键信号,从而在机体的正常发育和稳态中发挥不可替代的作用。原纤毛结构和/或功能异常会导致一系列包括肿瘤在内的疾病。原纤毛与细胞周期具有双向调控作用,可能可以作为一个细胞周期的检查点来抑制肿瘤的发生和发展;与细胞自噬相互调控,可能通过调控自噬活性从而在肿瘤的进展中发挥作用;与 Shh、Wnt、Notch 和血小板源性生长因子受体（PDGFR）等多个致癌性信号通路相互调控,参与肿瘤的发生发展。本综述总结了纤毛在肿瘤发生发展中的作用以及该领域所面临的挑战。     

血管扩张刺激磷蛋白与微管蛋白的结合

目的 探讨血管扩张刺激磷蛋白(VASP)及其丝氨酸157(p-VASP S157)和239(p-VASP S239)位点磷酸化与α 微管蛋白(α-Tubulin) 之间的关系,明确VASP是一个新的微管相关蛋白。方法 采用免疫荧光染色观察p-VASP S157、 p-VASP S239和α-Tubulin在人宫颈癌上皮细胞HeLa的共定位; 利用免疫共沉淀、微管沉淀和Western blot方法明确VASP及其不同位点磷酸化与α-Tubulin的结合情况。结果 VASP和p-VASP S157能够与α Tubulin结合; p-VASP S239在细胞周期各个时期与α-Tubulin均无共定位关系。结论 VASP是一个新的微管相关蛋白,其丝氨酸157磷酸化与二者的结合相关。     

α-茄碱通过ROS/线粒体途径促进鼻咽癌细胞凋亡的分子机制

目的：通过体外实验探讨α-茄碱对人鼻咽癌细胞CNE-2的作用及其潜在机制。方法：CCK-8法检测α-茄碱处理后CNE-2 细胞的活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Real-time PCR和Western blot实验检测CNE-2细胞内Bax、Bcl-2等凋亡相关基因和蛋白的表达水平。Mito-SOX流式细胞术检测线粒体ROS水平的变化;透射电子显微镜观察细胞线粒体超微结构。结果：α-茄碱显著抑制细胞活性,诱导细胞凋亡,呈时间与剂量依赖性。与对照组相比,10 μmol/L α-茄碱作用于CNE-2细胞48 h后,细胞内Aif和Caspase-8的表达量显著增加（P ＜0.01）;Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值显著降低（P ＜0.05）。α-茄碱引起线粒体内ROS水平显著升高,透射电镜结果显示了CNE-2细胞中线粒体的损伤。结论：α-茄碱能抑制细胞增殖活性,引起ROS水平升高,进而导致线粒体损伤,最终通过线粒体途径诱导CNE-2细胞凋亡。     

保护素对原代肺成纤维细胞炎症及纤维化增殖的影响

目的：探讨保护素（PDX）对脂多糖（LPS）诱导的原代肺成纤维细胞环氧合酶-2（COX-2）表达的影响及对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导其纤维化增殖转化的影响。方法：分离、纯化、鉴定得到小鼠肺成纤维细胞,用LPS诱导建立成纤维细胞体外炎症模型,用TGF-β1诱导建立体外纤维化增殖模型。PDX分别作用于经过LPS或TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞。采用细胞浓度试剂盒测定细胞增殖,采用实时定量PCR测定基因表达,采用ELISA法检测细胞上清液前列腺素E2（PGE2）水平,应用Western blot检测COX-2蛋白的表达。结果：采用10 ng/mL TGF-β1刺激诱导体外培养的原代肺成纤维细胞48 h能建立较为合理的体外纤维化增殖模型。PDX抑制LPS诱导的原代肺成纤维细胞COX-2蛋白的表达及上清液PGE2水平,同时可能通过剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞的增殖。PDX抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、纤连蛋白的基因表达。结论：PDX能抑制LPS诱导的小鼠原代肺成纤维细胞COX-2表达及PGE2水平,同时能抑制TGF-β1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞纤维化增殖、胶原蛋白合成及向肌成纤维细胞转化。     

MIP-3α-SA双功能融合蛋白的制备及其生物学功能鉴定

目的：制备链亲合素（SA）连接的MIP-3α融合蛋白MIP-3α-SA,并研究其生物学活性及功能。方法：构建MIP-3α-SA-pET21重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达MIP-3α-SA融合蛋白,经镍金属螯合（Ni-NTA）层析纯化,尿素梯度透析复性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）、Western blot及银氨染色法鉴定融合蛋白;通过体外淋巴细胞趋化实验验证其趋化活性,流式细胞术分析其对已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1细胞的表面锚定修饰效率。结果：MIP-3α-SA融合蛋白可在大肠杆菌Rosetta（DE3）中实现高效诱导表达,表达量占细菌总蛋白量的30%。经镍柱亲和层析纯化后该融合蛋白纯度达到95%。经尿素梯度复性后,验证该融合蛋白具有双重活性,即：MIP-3α介导的对人淋巴细胞的趋化作用且呈剂量依赖性,及SA介导的高效结合至表面已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1细胞的功能（表面锚定修饰效率大于95%）。结论：MIP-3α-SA双功能融合蛋白具有双重活性,为MIP-3α表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定基础。     

蛋白激酶A调节亚基1α在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的：研究蛋白激酶A调节亚基1α(cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit,PRKAR1α)mRNA及蛋白在非小细胞肺癌中的表达并分析其临床意义。方法：应用实时荧光定量PCR、免疫组织化学测定79例非小细胞肺癌癌组织及癌旁正常肺组织内PRKAR1α mRNA和蛋白的表达情况,结合相关临床资料进行统计学分析。结果：PRKAR1α在非小细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌的阴性表达率分别为58.2%,77.8%,32.4%。与癌旁正常肺组织相比,PRKAR1α在肺腺癌组织内mRNA及蛋白水平呈现低表达,差异有统计学意义(P<0.05);而肺鳞癌组织PRKAR1α mRNA及蛋白水平与正常癌旁肺组织相比差异无统计学意义(P>0.05)。与肺鳞癌相比,肺腺癌PRKAR1α阳性表达率明显下降(P<0.001);与TNM分期I~II比较,III~IV PRKAR1α阳性表达率明显降低(P=0.025);有淋巴结转移者PRKAR1α阳性表达率低于无淋巴结转移者(P=0.011)。不同年龄、性别、肿瘤分化及大小、是否吸烟组间PRKAR1α阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。结论：PRKAR1α在非小细胞肺癌不同组织病理学分型中具有差异表达;在肺腺癌内呈现低表达,与肺癌分期、淋巴结转移相关,可能成为临床诊断、治疗肺腺癌新的分子靶标。