d-Penicillamine2,5-enkephalin作为底物考察三明治大鼠原代肝细胞的转运体功能研究

目的: 通过液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)法测定d-Penicillamine2,5-enkephalin (DPDPE)在肝细胞和Hank's缓冲液中的浓度,研究DPDPE作为底物用于“三明治”培养大鼠原代肝细胞(SCRH)的转运体功能。方法: 将SCRH与溶于Hank's缓冲液的DPDPE共温孵,采用LC/MS/MS法测定细胞内蓄积的和外排到缓冲液中的DPDPE浓度,用于评价模型药物α-萘异硫氰酸酯(ANIT)对参与DPDPE摄取的Oatp和负责DPDPE外排的Mrp2的转运功能的影响。结果: 建立的样品处理和测定方法能够满足体外转运实验需要的灵敏度和线性范围,在Hank's缓冲液中线性范围为0.5~50 ng/mL(r²=0.9995),在细胞基质中线性范围为 0.1~5 ng/well(r²=0.9997),样品处理操作简便。日内日间精密度(RSD)均小于15%;提取回收率大于65%。ANIT可抑制DPDPE在SCRH胆管侧的外排及基底侧的摄取,对基底侧外排无显著影响。结论: 该分析方法选择性好,灵敏度高,操作简便,并成功地用于将DPDPE作为探针底物研究SCRH模型上转运体的功能。     

鲨肝刺激物质降血糖作用机制的研究

目的:研究鲨肝刺激物质的降血糖作用机制。方法:采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型, 观察鲨肝刺激物质对糖尿病小鼠空腹血糖、果糖胺、胰岛素、肝糖原、己糖激酶、过氧化脂质等生化指标的影响。采用离体培养原代小鼠肝细胞, 研究鲨肝刺激物质对四氯化碳、对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用。结果:鲨肝刺激物质显著降低糖尿病小鼠空腹血糖和果糖胺水平, 增加血清胰岛素、肝糖原含量, 提高己糖激酶活性, 减轻四氯化碳、对乙酰氨基酚对原代小鼠肝细胞的损伤。结论:鲨肝刺激物质降血糖作用机制与保护胰岛和肝细胞功能、提高己糖激酶活性、促进肝糖原合成和抗氧化损伤作用密切相关。     

葛根素对胰岛素抵抗大鼠脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4的影响

目的: 探讨葛根素对高糖高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达水平及其转位机制的影响。方法: 实验大鼠随机分为正常组、模型组和葛根素组,每组10只。模型组和葛根素组大鼠喂以高糖高脂饲料,4周后葛根素组大鼠予以葛根素100 mg·kg^-1·d^-1腹腔注射。以Western blot 法检测各组大鼠脂肪细胞GLUT4 的含量,定期检测实验大鼠的体质量、血甘油三酯和胆固醇、空腹血糖及血浆胰岛素水平,并计算胰岛素敏感指数。结果: 模型组大鼠脂肪细胞内膜GLUT4含量较正常组减少38.72 %(P<0.05),细胞外膜减少21.91 %(P<0.05)。给予葛根素治疗6周后,大鼠脂肪细胞内膜GLUT4 的含量与模型组相比无明显变化,而细胞外膜GLUT4含量增加21.46 %(P<0.05)。结论: 葛根素可提高胰岛素抵抗大鼠脂肪细胞GLUT4蛋白表达水平,且能够改善其转位机制,从而加强葡萄糖的摄取和利用。     

NIDDM 大鼠骨骼肌组织GLUT 4 mRNA表达及其与胰岛素分泌关系的实验研究

目的 观察非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)大鼠骨骼肌葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)mRNA 表达及其与胰岛素分泌的关系。方法 制备NIDDM大鼠模型,用Northern blot方法测定骨骼肌组织中GLUT4mRNA表达量;放射免疫法测定血清胰岛素含量;免疫组化法观察胰岛胰岛素阳性β细胞。结果 NIDDM大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达显著低下,仅为对照组的45%(P<0.01);其空腹基础胰岛素水平正常,但葡萄糖耐量试验胰岛素水平较对照组明显降低,2 h 胰岛素分泌有延迟现象;免疫组化实验NIDDM大鼠胰岛体积减少一半以上,胰岛素阳性β细胞数量明显减少。结论 NIDDM大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达量低下,该反应与体内胰岛素分泌水平呈现一定的正相关性。;     

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的: 为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型, 并鉴定肝细胞的功能。方法: 在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB 法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响。结果: 分离得到的肝细胞成活率可达90 %以上, 纯度可达95 %以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G₀ /G₁ 期, 且基本无凋亡;SRB 法和白蛋白分泌量检测结果显示, 低糖DMEM 组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1 ~ 5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640 组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P <0.05)。结论: 体外培养的肝细胞活力和纯度均较高, 体外培养后细胞功能正常, 是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。     

大蒜素对肝脏药物转运体OATP1B1转运功能的影响

目的: 观察大蒜素对肝脏药物转运体-有机阴离子转运多肽1B1(Organic anion transporting polypeptide 1B1, OATP1B1)转运功能的影响。方法: 利用稳定表达人OATP1B1的人胚胎肾293(Human embryonic kidney 293, HEK293)细胞株,以[³H]硫酸雌酮和普伐他汀为底物进行OATP1B1摄取反应,观察大蒜素对OATP1B1摄取功能的影响。结果: 大蒜素对OATP1B1摄取[³H]硫酸雌酮和普伐他汀的功能有竞争性抑制作用,抑制常数K_i值分别为(18.3±5.2) μmol/L 和(15.4±6.8) μmol/L。结论: 大蒜素对肝脏药物转运体OATP1B1转运功能的抑制作用可诱导中药-西药相互作用。     

白藜芦醇及其糖苷白藜芦醇苷与药物外排转运体的相互作用研究

目的: 通过多种不同细胞模型研究两种芪类天然化合物白藜芦醇(trans-resvenatrol,TR)及白藜芦醇苷(transpiceid,TP)与多种药物外排转运体间的相互作用。方法: 高效液相及荧光分光光度法分别测定细胞内TR.TP及罗丹明123的浓度MTT比色法测定细胞活性,Westemblot法测定P-糖蛋白的表达。结果: P-糖蛋白抑制剂及底物(维拉帕米和罗丹明123)对TR及TP的细胞摄取无影响。多药耐药相关蛋白2抑制剂,丙磺舒可将TR及TP的细胞摄取量分别增加1.3倍和1.6倍。TR及TP能够显著性增加大鼠脑微血管细胞对罗丹朋123的摄取及阿霉素在人白血病阿霉素耐药细胞上的毒性,但对人白血病阿霉素耐药细胞上P-糖蛋白的表达没有显著性改变。米托蔥醌在人非小细胞肺癌细胞.上的毒性作用不受TR及TP的影响。结论: TR及TP可以抑制P-糖蛋白的外排作用,但其本身不被P-糖蛋白外排,而是被多药耐药相关蛋白2外排。TR及TP对人乳腺癌多药耐药蛋白的外排作用没有影响。     

重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)对正常动物降糖作用的实验研究

目的 观察rhGLP-1(7-36) 对正常动物的降血糖和促胰岛素分泌作用以及该作用的葡萄糖依赖性。 方法 用不同动物模型sc 不同剂量的rhGLP-1(7-36) 后, 收集血清, 测定血糖值及胰岛素值。 结果 正常C57 小鼠和家兔sc 不同剂量的rhGLP-1(7-36) 后, 血糖和胰岛素分泌均无明显改变, 提示rh-GLP-1(7-36) 并不影响血糖正常动物的胰岛素分泌及血糖;对于给糖负荷动物, rhGLP-1(7-36) 使其胰岛素分泌增加, 并进而使升高的血糖明显降低, 表明rhGLP-1(7-36) 具有明显的葡萄糖依赖的促胰岛素分泌作用。在C57 小鼠和家兔糖耐量实验中发现, rh-GLP-1(7-36) 16 μg·kg-1使糖负荷家兔胰岛素分泌增加, 血糖升高曲线明显降低, 说明rhGLP-1(7-36) 能明显增加动物对糖的耐受。 结论 rhGLP-1(7-36) 通过葡萄糖依赖的胰岛素分泌作用降低过高血糖, 而不降低正常血糖, 同时用量小, 起效快, 安全性高。     

黄芪总提物对体外肝细胞损伤的保护作用1

目的 研究黄芪总提物(TEA)对体外肝细胞损伤的保护作用及其机理。方法 采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用CCl 4 和H 2O 2体外分别诱导肝细胞损伤,检测肝细胞丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)活性以及培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AS T)和/或丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平。结果 (1)TEA(5~80 mg·L^-1)可明显降低或恢复由CCl₄升高的肝细胞MDA 含量及肝细胞培养上清液中AST水平,还可使CCl₄降低的肝细胞GSH 含量和GSHpx 活性升高或恢复;(2)TEA(5~80 mg·L^-1)可使H₂O₂升高的肝细胞培养上清液中ALT水平和肝细胞MDA含量明显降低或恢复,还可使H₂O₂降低的肝细胞GHS含量和GSHpx活性明显升高或恢复。结论 提示TEA 对体外肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

异甘草素对醋氨酚诱导的急性肝细胞损伤的保护作用

目的 研究异甘草素(isoliquiritigenin, ISL)对醋氨酚(AAP)诱导的肝细胞损伤的保护作用及机制。 方法 以AAP 20 mmol L 培养原代肝细胞12 h 造成急性化学性肝损伤模型。肝细胞随机分为正常组,AAP 损伤组, ISL 预处理组和ISL 加N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)预处理组。酶学测定培养液ALT 、AST 活性, 肝细胞CYP2E1 活性和谷胱甘肽(GSH)含量, RT-PCR 测定肝细胞CYP2E1 mRNA 表达水平, 放射免疫分析测定肝细胞cAMP 和cGMP 含量, 三明治ELISA 方法测定核转录调节因子(NF-κB 等)活性。 结果 ISL 浓度(5~ 20 μmol L)依赖性抑制AAP 引起的ALT 和AST升高;下调肝细胞CYP2E1 活性和mRNA 表达, 最大抑制率分别可达75.7%和78.7%, 同时明显抑制AAP 引起的肝细胞GSH 含量下降;加入LNAME 2.0 mmol L 可阻断ISL 20 μmol L 对肝细胞的保护作用;ISL 不能逆转AAP 引起的肝细胞cAMP 含量下降, 但可浓度依赖性提高cGMP 含量(最高可达4.75 倍);ISL 浓度依赖性抑制AAP 所致NF-κB 活性的提高, 抑制率分别为24.8%、37.3%和64.1%。 结论 ISL 对CYP2E1 介导的AAP 肝细胞损伤具有保护作用, 可能与通过NOcGMP通路, 抑制NF-κB 激活和下调CYP2E1 表达有关。     

棕榈酸对C2C12细胞Toll样受体及其炎症因子表达的影响

目的: 探讨棕榈酸(PA)刺激对C2C12细胞Toll样受体(TLRs)及其炎症因子表达的影响,初步分析TLRs介导的免疫性炎症与胰岛素抵抗(IR)的关系。方法: 不同浓度PA与C2C12细胞体外共培养 16 h,测定细胞葡萄糖消耗量以确定IR细胞模型成型情况。荧光定量PCR法测定IR细胞TLR1~5 mRNA表达情况,ELISA法测定细胞培养液中炎症因子TNF-α、IFN-β的含量。结果: PA刺激能明显降低C2C12细胞的葡萄糖消耗量,表现为IR。PA并可诱导C2C12细胞TLR2、TLR4 mRNA 高表达,使TNF-α、IFN-β分泌增加,而对TLR1、TLR3、TLR5 mRNA表达无明显影响。结论: TLR2、TLR4信号转导通路及其启动的炎症反应可能参与了PA诱导IR形成的病理过程。     

罗格列酮对高脂血症大鼠的胰岛素抵抗作用及其机制研究

目的: 研究罗格列酮及格列齐特对高脂血症大鼠胰岛素抵抗的改善作用及其机制。方法: 建立高脂血症大鼠胰岛素抵抗模型, 并将其分为模型组、罗格列酮组和格列齐特组, 观察罗格列酮和格列齐特对其糖耐量减退、血清血糖血脂、TNF-α、Fins 含量、肝细胞TG 含量、脂质过氧化和肝肾功能等的影响。结果: 罗格列酮和格列齐特均有可能改善高脂血症致胰岛素抵抗模型病鼠的IGT 状态, 给药2 h后不同程度地降低病鼠FSG 及TNF-α浓度(P <0.05), 显著降低病鼠肝组织中TG 含量(P <0.01),明显抑制MDA 产生(P <0.01) 及增强GSH 贮量作用(P <0.01) 。罗格列酮还可降低病鼠高胰岛素水平及Fins 浓度(P <0.01), 明显降低病鼠BUN 和Cr含量(P <0.05), 提高ISI(P <0.01) 及增强SOD 活性(P <0.05) 。结论: 罗格列酮能改善高脂饲养引发的胰岛素抵抗。     

阿司匹林对多囊卵巢综合征大鼠炎症反应的影响

目的: 探讨阿司匹林对多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)大鼠炎症反应的影响及其机制。方法: 采用人绒毛膜促性腺激素和胰岛素皮下注射建立PCOS模型,观察阿司匹林对PCOS大鼠体质量、卵巢重量和病理、血清TNF-α、IL-6、胰岛素水平及卵巢TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响。结果: 阿司匹林可剂量依赖性降低PCOS大鼠体质量和卵巢重量,减轻卵巢病理改变,血清TNF-α、IL-6、胰岛素含量和卵巢TNF-α、IL-6表达水平亦明显降低。结论: 阿司匹林可通过其抗炎作用对PCOS大鼠产生保护作用。     

新型格列酮类化合物ANY2对HepG2细胞糖代谢的影响

目的: 体外实验研究新型格列酮类化合物ANY₂对糖代谢的影响。方法: 采用高浓度胰岛素持续作用肝癌细胞株( HepG₂)24 h 建立胰岛素抵抗模型( IR-HepG₂),并观察ANY₂对细胞葡萄糖消耗(GC) 、对细胞内糖原含量、糖异生及糖酵解作用的影响。结果: ANY₂能显著增加 IR-HepG₂在高、中、低糖条件下的葡萄糖消耗, 并呈明显的剂量依赖性;增加 IR-HepG₂细胞内糖原含量,但与模型组相比,仅在高浓度差异有统计学意义;减少IR-HepG2 细胞以乳酸为底物的糖异生量;提高糖酵解作用中IR-HepG₂细胞乳酸的生成和细胞内丙酮酸激酶(PK) 活力。结论: ANY₂可显著改善IR-HepG₂ 细胞的糖代谢作用。     

荔枝核皂苷对高脂血症-脂肪肝大鼠的降血糖调血脂作用

目的: 研究荔枝核皂苷和罗格列酮对高脂血症-脂肪肝大鼠血糖血脂的影响。方法: 采用高脂血症-脂肪肝大鼠模型, 观察荔枝核皂苷和罗格列酮、格列齐特对病鼠空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量试验(OGTT) 后2 h 血糖(2hBG) 以及给药后2 h 空腹血清血糖(FSG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST) 及镜检肝组织病理学等指标的影响。结果: 荔枝核皂苷和罗格列酮能显著改善高脂血症-脂肪肝致胰岛素抵抗(IR) 模型大鼠的IGT, 降低OGTT 后2h BG 和FSG(P <0.05);并能显著降低病鼠TC、TG、LDL-C 含量(P <0.05～0.01), 显著提高HDL-C 含量(P <0.05);降低病鼠ALT、AST 活性和BUN、Cr 含量(P<0.05), 改善肝细胞脂肪变性(P <0.01) 。结论: 荔枝核皂苷和罗格列酮能提高胰岛素的敏感性, 调整高脂血症-脂肪肝所致的糖脂代谢障碍, 并具有改善病鼠肝肾功能的作用。     

LC-APCI-MS/MS法研究维氨酯在大鼠体内的排泄

目的: 建立LC-APCI-MS/MS法测定大鼠胆汁、尿液和粪便中维氨酯的浓度,对该药在大鼠体内的排泄规律进行研究,为临床试验提供依据。方法: 生物样本经处理后,采用Agilent TC C₁₈色谱柱,甲醇-水-甲酸(93∶7∶0.1)为流动相,辛伐他汀为内标,在三重四极杆串联质谱仪上,采用大气压化学离子化(APCI)、正离子方式选择性离子监测模式,维氨酯和内标的检测离子分别为m/z448283和m/z419285,分别测定尿液、胆汁和粪便中原型物的含量。结果: 胆汁、尿样、粪便中维氨酯的回收率均大于89%,日间和日内的变异系数均小于10%。胆汁和尿液中维氨酯在0.0808～40.4ng/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9972和0.9949),粪便中维氨酯在0.2525～101ng/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9990),维氨酯的定量下限为0.2pg,方法符合生物样品分析要求。维氨酯在粪便中72h内、在尿液中96h内、在胆汁中24h内原型药的平均累积排泄量分别为12.9%、0.003%、0.0001%。结论: 该方法灵敏度高,专属性强,样品前处理简便,分析速度快,可满足大鼠排泄研究中药物浓度测定的要求,大鼠灌胃给药(5mg/kg)后维氨酯从尿液和胆汁中排泄的原型药物很少。