细胞周期检测点激酶1shRNA联合环胞素A逆转K562/A02细胞多药耐药的实验研究

目的:研究联合阻断细胞周期检测点激酶1(Chk1)信号通路与P-糖蛋白(P-gp)泵功能2条途径对逆转K562/A02细胞多药耐药性的作用,探索有效的逆转白血病细胞耐药的策略.方法:通过电穿孔转染法将特异性靶向Chk1的短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)导入K562/A02细胞;MTT法测定CsA的非细胞毒性剂量;Chk1 shRNA与非细胞毒性剂量的CsA联用后,MTT法检测细胞的药物敏感性;流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期及细胞内阿霉素浓度的变化.结果:CsA浓度低于(2.95±0.39) mg/L时对K562/A02细胞的生长抑制率小于10%.Chk1 shRNA联合CsA(1 mg/L)使阿霉素对K562/A02细胞的IC50值由原来的(109.65±0.26) mg/L降至(2.44±0.51) mg/L,逆转倍数为45倍,明显增加了细胞敏感性;细胞凋亡率升至(66.74±1.62)%,与Chk1 shRNA或CsA单独处理组相比差异有统计学意义(P<0.05).Chk1 shRNA与CsA单独或联用均导致G2/M期细胞百分率显著下降,分别为(17.10±0.63)%、(14.60±0.97)%、(18.21±1.13)%,三者间差异无统计学意义(P>0.05).Chk1 shRNA联合CsA组细胞内阿霉素浓度为(22.06±0.56),与CsA处理组(20.44±0.79)比较,其差异无统计学意义(P>0.05).结论:Chk1基因的表达下调与P-gp泵功能的抑制两个靶点的联合能够更有效逆转白血病细胞的多药耐药.     

急性白血病多药耐药基因及多药耐药相关蛋白基因的表达及临床研究

目的探讨急性白血病（ＡＬ）多药耐药基因（ｍｄｒ１）及多药耐药相关蛋白基因（ＭＲＰ）的表达与预后的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）的方法检测５５例ＡＬ患者的ｍｄｒ１及ＭＲＰ的表达。结果发现复发急变组的ｍｄｒ１及ＭＲＰ基因表达水平（０．７３５±０．２４９,１．１５７±０．４４７）较初治组（０．４０８±０．１８６,０．４６５±０．２５３）明显升高（Ｐ＜０．０１）。而且ｍｄｒ１及ＭＲＰ同时高表达者的完全缓解（ＣＲ）率明显低于ｍｄｒ１及ＭＲＰ同时低表达者（Ｐ＜０．０１）。结论ｍｄｒ１和ＭＲＰ同时高表达是判断ＡＬ患者耐药复发及不良预后的重要因素。     

地西他滨联合阿霉素逆转白血病K562细胞株多药耐药作用观察

目的观察地西他滨（DCA）联合阿霉素（ADR）对白血病K562细胞株多药耐药的逆转作用,探讨其治疗白血病的可行性。方法以不同浓度DCA＋ADR处理K562/ADR细胞,用台盼蓝法观察药物对细胞生长曲线的影响,MTT法检测不同浓度DCA与ADR对K562/ADR细胞的杀伤活性,流式细胞技术检测细胞膜P糖蛋白及细胞内ADR浓度。结果 DCA＋ADR对白血病K562细胞株多药耐药有明显逆转作用,可降低细胞膜P糖蛋白表达,提高K562耐药细胞株对ADR的敏感性。结论 DCA联合ADR可逆转白血病K562细胞株多药耐药性。     

保尔佳对白血病细胞系K562/A02耐药性的逆转作用

应用MTT法测定不同浓度保尔佳作用后，K562、K562／A02细胞对柔红霉素（DNR）的敏感性变化，流式细胞仪测定1．5μg／ml保尔佳对细胞内Rh123浓度及糖蛋白p-170、谷胱甘肽S-转移酶π（GST-π）多药耐药相关蛋白表达的影响。发现保尔佳在无毒剂量（1．5μg／ml）能增强DNR对K562／A02的毒性作用，逆转倍数为5．93倍；能增加K562／A02细胞内Rh123浓度，下调P-170、GST-π的表达。提示保尔佳是一种潜在的白血病化疗增敏剂。     

维拉帕米对多药耐药胃癌细胞耐药逆转作用的研究

肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药 ,并且这些药物之间化学结构及作用机制可以互不相同 ,这种现象称为多药耐药性 (ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｒｕｇｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ,ＭＤＲ)。目前的研究表明 ,ＭＤＲ的产生与耐药细胞膜上Ｐ 糖蛋白 (Ｐ ｇｐ)水平呈正相关 ,钙通道阻滞剂可对部分肿瘤细胞耐药起逆转作用[1,2 ] 。本研究旨在分析肿瘤细胞耐药与Ｐ ｇｐ表达的关系 ;观察维拉帕米 (ＶＥＲ)逆转耐药的程度 ,探讨ＶＥＲ逆转耐药与Ｐ ｇｐ的关系。一、材料与方法1.细胞及主要试剂 :胃癌细胞株ＳＧＣ790 1(中山医科大学动物实验中心提供 ) ,胃癌耐…     

Smac基因过表达对白血病耐药细胞株K562/AO2化疗敏感性的影响

目的 探讨Smac基因过表达对K562/A02细胞株化疗敏感性的影响.方法 构建重组腺病毒载体pAdeno-Smac,转染K562/A02细胞.实验分组:A组:pAdeno-Smac转染组;B组:空载体转染对照组;C组:正常对照组.Western blot检测转染前后细胞内Smac蛋白的表达水平.将终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5 mg/L的柔红霉素处理各组后,Annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率.结果 成功构建腺病毒载体pAdeno-Smac质粒.Western blot结果证实,经Smac基因全长cDNA转染后,K562/A02细胞中的Smac蛋白表达显著升高.经不同浓度柔红霉素处理后,A组的细胞早期凋亡率明显高于B组和C组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),且随着柔红霉素浓度的升高,细胞凋亡率随之升高,B组和C组之间差异无统计学意义.结论 重组腺病毒载体pAdeno-Smac可通过使K562/A02细胞中的Smac蛋白表达增高,增强细胞对化疗药物的敏感性.     

异汉防己碱逆转白血病K562/DOX细胞多耐药性的实验研究

目的探讨中药十大功劳中异汉防己碱对白血病K562/DOX细胞多药耐药性（multidrug resistance,MDR）的逆转作用。方法采用MTT法检测异汉防己碱的内在细胞毒性及其对阿霉素（DOX）的增敏作用,并以逆转倍数（RF）值评价其逆转效果;应用免疫组化方法检测K562/DOX细胞膜上P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）表达水平及异汉防己碱对P-gp表达的影响;应用流式细胞仪分析细胞内罗丹明123（rhodamine123,Rh123）和DOX浓度;以维拉帕米（verapamil,VER）为阳性对照。结果异汉防己碱在10μg/ml的无毒剂量下可明显增强DOX的细胞毒性,RF=4.86,明显高于维拉帕米（RF=2.65）的逆转活性（P〈0.05）;K562/DOX细胞膜上P-gp呈强阳性表达,但异汉防己碱对该P-gp表达水平无明显影响;异汉防己碱使细胞内Rh123和DOX的浓度明显增加。结论异汉防己碱可通过抑制P-gp功能而有效逆转白血病细胞的多药耐药性,它有望成为肿瘤多药耐药逆转剂的候选药物。     

逆转MDR—l基因相关的消化系统肿瘤多药耐药

消化系统恶性肿瘤细胞多药耐药是导致化疗失败的重要原因。多药耐药基因(MDR—1)过度表达P—糖蛋白(p-gp)是产生耐药的主要机制。逆转MDR—l基因相关的消化系统肿瘤多药耐药，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的方式有两类：一是直接抑制p-gp的药泵功能；二是干扰MDR—l基因的表达。     

反义核酸逆转人白血病多药耐药细胞株耐药性的实验研究

目的 采用一段人工合成的互补于多药耐药基因的反义硫代磷酸寡核苷酸转染白血病多药耐药细胞株Ｋ５６２／ＡＤＭ,来逆转白血病细胞的多药耐药。方法 四唑蓝快速比色法检测Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞对阿霉素的半数抑制量,流式细胞仪分析细胞内的柔红霉素含量,免疫细胞化学染色方法确定Ｐ１７０的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测ｍｄｒ１－ｍＲＮＡ的相对水平。     

钙离子载体A23187对人红白血病细胞株K562超微结构的影响

目的观察钙离子载体A23187对人红白血病细胞株K562超微结构的影响，为白血病的治疗提供新思路。方法体外培养K562细胞，密度增至（1-2）×10^5几时随机分为观察组和对照组（容积均为5mL），观察组取2mmol/L细胞溶液加入A23187溶液7．5灿，至最终浓度为3panol/L；对照组加入等体积生理盐水。细胞培养到第10、20和30Jnin时，依次取两组细胞溶液离心、制备超薄切片，H-7500型透射电镜下观察其超微结构。结果对照组K562细胞超微结构无明显改变；观察组K562细胞线粒体呈现空泡样改变和基质深染。结论钙离子载体A23187在体外可能通过改变人红白血病细胞株K562细胞超微结构诱导其凋亡，此为白血病的临床治疗提供了一种新思路。     

维拉帕米逆转胃癌细胞系SGC7901/VCR多药耐药性的研究

目的研究维拉帕米对人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR多药耐药性的逆转效应.方法利用RT-PCR、免疫组化以及MTT等方法,观察维拉帕米对体外培养SGC7901/VCR细胞系耐药性的逆转作用.结果RT-PCR、免疫组化和MTT结果表明维拉帕米可以使SGC7901/VCR的MDRl基因表达水平和P-gP糖蛋白表达降低,细胞对丝裂霉素、替加氟等药物的敏感性明显增加.结论维拉帕米在体外有逆转SGC7901/VCR胞多药耐药的效应.     

环孢素A逆转肿瘤多药耐药的临床观察

多药耐药（MDR）是恶性肿瘤化疗失败的原因之一,临床许多病人在经历了最初有效的化疗之后,最终仍难免于复发,此时再使用曾有效的药物或从未用过的药物,均不见疗效.其主要原因是肿瘤细胞对化疗产生了耐药性,多药耐药基因（MDR1）呈高表达.因此,逆转肿瘤细胞的耐受性是提高肿瘤化疗疗效的关键.国内外许多基础研究表明,很多药物可用来逆转肿瘤细胞的MDR.我们自2002年起用RT-PCR法检测MDR1表达,用免疫调节剂环孢素A口服逆转肿瘤MDR取得良好效果.     

环孢素A与干扰素联合逆转复发难治性急性白血病多药耐药的临床研究

目的:探讨环孢素A(CsA)与干扰素α(IFN-α)联合逆转复发难治性急性白血病(AL)多药耐药(MDR)的临床疗效。方法:采用免疫细胞化学ABC法和P-170单抗JSB-1对50例复发难治性AL患者进行P-170检测,并对其中34例P-170阳性患者随机分为逆转组(CsA加IFN-α联合化疗)及对照组(单用化疗)进行逆转MDR的研究。结果:P-170在复发难治性急性AL中有高表达(68％),逆转组逆转MDR的总有效率(64.7％)明显高于对照组(23.5％),统计学分析差异有显著性意义(P<0.05)。结论:CsA与IFN-α联合应用有可能成为较为安全有效的血液病逆转方法,在治疗复发难治性AL中具有良好的临床应用前景。     

初治急性白血病患者肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白基因表达与预后的关系

目的 探讨肺耐药蛋白（1rp)基因和多药耐药相关蛋白（mrp)基因表达与初治急性白血病（AL）患者化疗效果的关系。方法 用逆转聚合酶链反应方法检测58例初治AL患者骨髓单个核细胞中lrp和mrp的mRNA的表达。结果 初治急性淋巴细胞白血病（ALL）患者lrp和mrp阳性表达率分别为15．0％和40．0％, 初治急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者lrp和mrp阳性表达率分别为15．8％和42．1％;在ALL和ANLL组,lrp和mrp基因阳性与阴性患者的首次完全缓解（CR）经统计学分析,差异无显著性（P＞0．05）,而lrp和mrp基因双阳性与双阴性患者的首次CR经统计学分析,差异有显著性（P＜0．05）;lrp和mrp基因两者无相关性。结论 lrp和mrp单独作为预测初治AL患者化疗效果的敏感性较差,而两者联合检测则是预示原发耐药的良好指标。     

难治及复发性急性白血病多药耐药及其逆转剂的应用

多药耐药是白血病难治和复发的主要原因。所谓多药耐药性 ( MDR) ,即在化疗初期效果好 ,但经过几个疗程治疗后 ,肿瘤细胞不但对所用药 ,而且对其他结构和作用机理不同的多种来源的药物也产生交叉耐药性。1　 MDR产生的主要机制1.1　膜转运蛋白介导的药物外排泵机制　膜转运蛋白 P-糖蛋白 ( P- gp)、多药耐药相关蛋白 ( MRP)、肺耐药蛋白( L RP)和乳癌耐药蛋白 ( BCRP)可通过改变药物的转运 ,降低白血病细胞内药物浓度 ,使细胞对多种药物耐药。此类蛋白中除 L RP外均属 ATP结合盒 ( ABC)转运蛋白超家族成员 ,可作为能量依赖性外排…     

K562/A02细胞核糖体蛋白L6的表达与多药耐药性的实验研究

目的观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病多药耐药性的作用。方法通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1( )分别构建正向插入和反向插入的RPL6cDNA重组质粒,以脂质体将正义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562/A02细胞,以MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、米托蒽醌(MIT)和依托泊苷(VP16)耐药性的作用。结果RPL6在K562/A02细胞中的表达较K562增高(P<0.001),转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对ADM、VCR、MIT、VP16的耐药性比未转染的K562细胞分别增强3.25、1.95、2.00和3.48倍(P<0.05或0.01),转染反义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对ADM、VCR、MIT、VP16的耐药性比未转染的K562/A02细胞分别降低62%、50%、56%和47%(P<0.05或0.01)。结论RPL6基因过表达在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

丁硫氨酸硫酸亚胺逆转人结肠癌细胞多药耐药的机制

目的探讨丁硫氨酸硫酸亚胺(BSO)逆转人结肠癌LoVo／Adr细胞多药耐药性的可行性,并初步探讨其逆转机制。方法MTT法检测BSO对多药耐药LoVo／Adr细胞抗癌药物敏感性的影响; RT-PCR法检测细胞中多药耐药1(mdr1)基因及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-πmRNA水平;免疫组化染色检测GST-π蛋白水平;1氯-2,4-二硝基苯法测定GST活性。结果BSO作用后亲本LoVo细胞中阿霉素、丝裂霉素的IC50无显著变化,而在LoVo／Adr细胞中,阿霉素的IC50由(3．08±0．84)mg／L降至(1.31±0．53)mg／L(t=3．09,P<0．05),丝裂霉素的IC50由(1．24±0．45)mg／L降至(0．54±0．32)mg/L(t=165．50,P<0.01);BSO对mdr1基因mRNA水平无影响,BSO作用前后GST-πmRNA表达量分别为1．75±0.24和0．84±0．19(t=5．11,P<0．05),BSO作用后LoVo／Adr细胞GST-π蛋白表达显著低于处理前;BSO处理前后LoVo／Adr细胞GST活性分别为(144．26±50．13)和(129.58±41．36)U／mg(t=0,57,P>0．05)。结论BSO可有效增强人结肠癌耐药细胞LoVo／Adr对阿霉素、丝裂霉素的敏感性,具有逆转作用,其机制与mdr1基因无关,但与GST-π基因下调有关,可能是通过降低细胞内GST-π含量,增强对化疗药物的敏感性。     

结肠癌细胞多药耐药模型LoVo/Adr的建立及其耐药相关基因的表达

目的 建立结肠癌细胞多药耐药模型LoVo/Adr并研究其耐药机制。方法 采用阿霉素浓度递增法，建立人结肠癌细胞多药耐药模型LoVo/Adr，观察其生长规律；用MTT法鉴定耐药细胞株的耐药性；以流式细胞检测其周围分布；用RT－PCR方法检测耐药相关基因mdr1,MRP,GST-π及TopoⅡmRNA水平在诱导耐药过程中的变化；采用免疫组化法检测P-gp的表达。结果 LoVo/Adr细胞与LoVo细胞相比，生长缓慢，倍增时间延长，细胞形态较不规则，S期细胞减少，而G1，G24期增多P－gp染色阳性。LoVo/Adr对阿霉素，长春新碱，丝裂霉素，环磷酰胺和5－FU耐药倍数分别是61倍，14倍，3倍，9倍和1倍。亲本LoVo细胞mdr1不表达随着阿霉素诱导mdr1 mRNA水平逐渐增高，GST－πmRNA在诱导初期显著增高，但不随着对阿霉素耐受浓度增加而升高；ToopⅡmRNA水平一直无显著变化；未测到MRP的表达。结论 耐药株LoVo/Adr是一个表达MDR表型的多药耐药模型，主要由mdr1和GST－π基因介导耐药，与TopoⅡ和MRP基因无关。     

bcl-2对人小细胞肺癌细胞系H446/DDP多药耐药性的影响

目的探讨bc l-2表达上调对人小细胞肺癌(SCLC)多药耐药的影响及相关机制。方法通过定向克隆方法,构建bc l-2正义RNA真核表达载体pLXSN-bc l-2;同时,体外合成bc l-2反义硫代磷酸寡核苷酸(AS-PS-ODNs),然后采用脂质体分别将其转染至人SCLC H446细胞及H446/DDP细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和W estern b lot方法检测转染细胞中bc l-2 mRNA和蛋白的表达水平;流式细胞仪DNA倍性分析观察顺铂(DDP)诱导转染细胞凋亡情况。转染时细胞分3组,pLXSN-bc l-2转染组[或bc l-2 AS-PS-ODNs转染组(AS-PS-ODNs转染组)]、pLXSN转染组[或bc l-2无义硫代磷酸寡核苷酸转染组(NS-PS-ODNs转染组)]和对照组(H446细胞组、H446/DDP细胞组)。结果(1)W estern b lot检测结果表明,对照H446细胞组、pLXSN转染组、pLXSN-bc l-2转染组间Bc l-2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=11 221,P<0.05)。转染pLXSN-bc l-2的H446细胞强表达Bc l-2蛋白(灰度值0.854±0.016),与对照H446细胞组(灰度值为0.103±0.005)相比差异有统计学意义(t=2.45,P<0.01);NS-PS-ODNs转染组的H446/DDP细胞,AS-PS-ODNs转染组的H446/DDP细胞,对照H446/DDP细胞组间Bc l-2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=11 028,P<0.01)。转染bc l-2AS-PS-ODNs的H446/DDP细胞表达Bc l-2蛋白水平(灰度值为0.695±0.014),与对照H446/DDP细胞组(灰度值为0.942±0.018)相比,显著下降(t=2.26,P<0.01),但仍高于亲代H446细胞Bc l-2表达水平(t=2.31,P<0.01)。(2)流式细胞仪DNA倍性分析结果显示,转染pLXSN-bc l-2的H446细胞,经5μg/m l DDP诱导后凋亡率为(20.9±0.2)%,明显低于对照H446细胞组的(31.1±0.21)%,差异有统计学意义(t=2.45,P<0.01);5μg/m l DDP诱导转染AS-PS-ODNs的H446/DDP细胞的凋亡率为(31.5±0.4)%,对照H446/DDP细胞组的凋亡率为(9.0±0.1)%,转染细胞的凋亡率显著增加(P<0.05)。结论靶向性抑制抗凋亡相关基因bc l-2的表达可能是克服SCLC化疗耐药的重要的基因治疗方法之一。