脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗生物学特征

目的　利用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞和食管癌细胞融合疫苗 ,研究融合疫苗的生物学特征。方法　免疫磁珠法分离脐血CD34 干细胞 ,细胞因子诱导扩增为成熟树突状细胞 (DC) ;用聚乙二醇法 (PEG)将DC与食管癌细胞EC10 9融合 ,免疫磁珠法筛选阳性克隆EC10 9-DC ;利用流式细胞术鉴定融合疫苗表型 ;绘制融合疫苗生长曲线。结果　融合疫苗EC10 9-DC可在体外培养生长 ,高表达CD80 ,CD83和CD86 ,增殖活性低于EC10 9。结论　融合疫苗EC10 9-DC细胞具备了刺激免疫细胞活化的分子表型 ,为食管癌的特异性免疫治疗提供新的理论依据。     

脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗抗肿瘤免疫预防实验研究

目的用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞（DC）和食管癌细胞的融合疫苗,观察其在体内诱导抗肿瘤免疫反应。方法分离脐血CD34^＋干细胞并诱导扩增为成熟DC,并与EC109细胞经聚乙二醇（PEG）法融合;免疫磁珠法筛选EC109-DC;重建SCID小鼠免疫功能;体内保护抗肿瘤免疫保护实验。结果①融合疫苗可体外生长,形状以不规则形为主,核仁大、细胞边缘可见突起;②重建SCID小鼠免疫功能实验中PBL组均检测到人IgG的存在,与PBS组相比较有显著意义（P〈0．05）;③在免疫保护中,经融合瘤苗免疫的小鼠,肿瘤潜伏期较对照组明显延长（P〈0．05）,肿瘤大小和肿瘤重量均明显小于对照组（P〈0．05）。结论①重建SCID小鼠免疫功能实验中PBL组均检测到人IgG的存在,提示免疫重建成功;②融合瘤苗对EC109细胞的攻击有明显的抵抗作用。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

食管癌细胞株中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及生物学鉴定

目的:用无血清培养基方法从人食管癌细胞株KYSE-150?TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性?方法:运用无血清培养基培养KYSE-150?TE-1细胞,观察细胞球的生成及在有血清培养基中的分化情况,利用MTT法以及Transwell小室法研究食管癌细胞球的增殖情况和侵袭能力,流式细胞仪检测分子标志CD44?CD271的表达?结果:KYSE-150?TE-1细胞在无血清培养基培养条件下可以获得可稳定传代的细胞球,细胞球细胞的增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞;无血清培养基培养下KYSE-150细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞分别为(64.92 ± 11.04)%?(28.27 ± 6.79)%?(24.07 ± 5.39)%,均显著高于亲本细胞[(37.04 ± 6.30)%?(3.69 ± 0.49)%?(1.64 ± 0.11)%,P均< 0.05]?TE-1细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞占(6.41 ± 0.87)%?(2.58 ± 0.17)%?(0.27 ± 0.53)%,均显著高于亲本细胞[(1.87 ± 0.18)%?(0.44 ± 0.10)%?(0.09 ± 0.02)%,P均< 0.05]?结论:应用无血清培养基可以从KYSE-150?TE-1细胞系中分离出具有干细胞特性的食管癌细胞球,CD44?CD271分子可能是食管癌干细胞的标志?     

脐血造血细胞分离和冻存的研究

用６％羟乙基淀粉学淀，比重１．０７７，１．０８０的Ｆｉｃｏｌｌ－泛影葡胺及比重１．０８０的Ｐｅｒｃｏｌｌ分层分离脐血有核细胞，发现以比重１．０８０的Ｐｅｒｃｏｌｌ分层后粒－单核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ０回收率最高，可达１０４％，随全血加入培养体系中的少量血浆会明显影响ＣＦＵ－ＧＭ回收率的计算，６例脐血用不同保护剂及降温方法冻存证明－７０℃冰箱降温效果接近甚至优于程控降温，结果表明，用Ｐｅｒｃ     

脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

褪黑素联合顺铂对人食管癌Eca109细胞的抑制作用及其机制

目的:观察褪黑素(Mel)联合顺铂(DDP)对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用,并探讨相关的分子机制。方法:通过MTT实验检测Mel与DDP不同浓度分别单用或两药联合处理后食管癌Eca109细胞增殖情况;流式细胞仪检测用药后细胞凋亡情况;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:Mel与DDP联用对食管癌Eca109细胞增殖的抑制率均高于单用Mel与DDP时对食管癌Eca109细胞的抑制率(P<0.05);Mel单独诱导食管癌Eca109细胞凋亡作用不强,但可增强DDP诱导的食管癌细胞凋亡(P<0.01);Mel与DDP联用后食管癌Eca109细胞Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达增强。结论:Mel可增强DDP对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,并具有增强DDP诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用,其机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2的表达有关。     

肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

目的将肝细胞癌(HCC)患者树突状细胞(DCs)与肝癌细胞HepG2融合制备瘤苗,检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应.方法以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞(PBMCs),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhlL-4)体外诱导培养DCs;聚乙二醇融合DCs与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(DCs/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒性实验检测DCs/HepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果融合细胞DCs/HepG2高表达成熟DC表面分子,其中CD8390.4%,CD8087.7%,CD8684.4%,HLA-DR98.5%;其刺激同源T淋巴细胞增殖的能力显著高于HepG2和DCs;DCs/HepG2活化的CTL对HepG2具有显著杀伤作用,其杀伤率为(63.5±4.6)%(效靶比例为20∶1).结论HCC患者外周血DC融合HepG2细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫效应,可能成为HCC免疫治疗的有效途径.     

CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应

目的：探讨CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应。方法：培养Eca-109细胞,用酸洗法收集细胞膜表面小肽,再用去盐、浓缩、超滤法纯化这些小肽后,以此刺激人外周血树突状细胞（DC）作为人食管癌疫苗,不用小肽刺激的DC作为对照疫苗,并用这些疫苗加佐剂CpG基序激活纯化的T细胞。实验分组：①CpG基序加食管癌疫苗组（CpG—Ve）;②CpG基序加食管癌对照疫苗组（CpG—Vc）;③单纯食管癌疫苗组（Ve）;④单纯食管癌对照疫苗组（Vc）;⑤单纯CpG基序刺激组;⑥直接用纯化的T细胞加Eca-109细胞作效应对照组。用^3H渗入法对各组行T细胞增殖试验,用^51Cr释放试验测定各组细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。结果：CpG-Ve组的T细胞增殖活性和CTL对Eca-109细胞杀伤率均高于其余各组（P〈0．01）。结论：CpG基序可能是人食管癌疫苗研究中的有效佐剂。     

口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法: 口腔癌患者(实验组)及正常人(对照组)15例外周血单个核细胞经GM-CSF,IL-4及TNF-α诱导培养, 获取成熟DC, 光镜和电镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLA-DR等分子的表达变化,用噻唑蓝(MTT)法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果: 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养,均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83,CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3,与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P＜0.05),CD86,CD80和HLA-DR的表达率分别为85.5±8.7,83.2±8.1和78.3±5.4,与对照组三者表达率89.2±6.7,87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P＞0.05);实验组DC细胞CD83,CD1a,CD86,CD80和HLA-DR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13,3.96±1.15,12.33±6.75,19.63±8.12和39.44±7.9, 均低于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论: 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC,该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.