不同无血清培养体系对人脐带间充质干细胞生物学功能的影响

目的 探讨3种不同无血清培养体系对人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）体外培养的生物学功能的影响。方法 取3株脐带组织,各分3组实验组,经贴壁法分别置于3组不同无血清培养体系（A组：纯化学成分合成的无血清培养体系,B组：血小板裂解物+基础培养基的无血清培养体系,C组：纤维蛋白原包被+含重组人蛋白质的无血清培养体系）中培养至第3代,比较其细胞增殖能力、细胞表型、三系分化能力以及免疫调节功能。结果 3组实验组细胞均呈长而扁平的梭形,贴壁生长,大小均一。其增殖曲线趋势相似,A组和B组P2、P3代次的增殖能力优于C组（P均<0.05）。3组实验组细胞均符合国际干细胞协会对hUC-MSC细胞表面标志物鉴定的要求,A组和B组P3代次的CD29和CD90的表达量均高于C组（P均<0.05）,并且3组实验组均具有三系分化能力。3组实验组中P3代次的T淋巴细胞增殖率、Th1和Th17细胞亚群分泌的细胞因子比例均低于对照组,调节性T细胞（CD4+CD25+FOXP3+）比例均高于对照组,而3组实验组之间两两比较差异无统计学意义（P均> 0.05）。结论 3种不同无血清培养体系的hUC-M...     

无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

背景：以含血清培养基培养的脐带间充质干细胞,存在着进一步应用的障碍。目的：建立无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞。方法：取脐带华通氏胶(Wharton’s Jel y),采用机械法将组织胶切碎,1-3 mm3大小,分别培养到含胎牛血清完全培养液中以及无血清培养液中。培养第11,14,17天收获细胞并进行相关检测。在符合2006年制定的干细胞最低评估标准的基础上,以集落形成单元指标评估何种培养体系能获得较多高质量的原代细胞。结果与结论：无血清培养体系相对于经典的含血清的培养体系而言,细胞生长速度更快。另外,培养第11天,集落形成实验表明无血清培养体系下能获得更多的集落。因此,无血清培养体系可以保持间充质干细胞的特性,为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

脐带间充质干细胞分离培养和生物学特性的初步研究

目的 建立从脐带分离间充质干细胞的分离培养方法,探讨研究其基本生物学特征.方法 无菌条件下收集健康孕妇剖宫产的新生儿脐带,用酶消化法获取间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),经传代培养、倒置显微镜观察形态、细胞增殖能力观察及流式细胞仪检测脐带间充质干细胞免疫表型.结果 经传代培养后,脐带间充质干细胞呈长梭形、旋涡状生长.细胞免疫表型显示,CD34,CD45,CD14阴性;CD90,CD73,CD105阳性.结论 脐带间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞形态无明显变化,且免疫表型类似,是一种新的间充质干细胞来源.     

脐血间充质干细胞的无血清培养

目前间充质干细胞（MSC）培养均在培养体系中加入一定比例的血清.但是用这种方法培养的细胞可能存在动物携带的已知或未知病原体传染人类的隐患.对以后可能的临床应用构成生物威胁.近年有人报道,用正常人AB血清或脐血血清替代胎牛血清来培养人骨髓MSC.但血清中的成分十分复杂,至今尚不完全清楚.既含有刺激物质也有抑制物质,有的物质可起抑制作用或毒性作用.此外,个体血清之间所含激素和生长因子的变化甚大.对研究细胞的定向诱导分化机制非常不利.我们利用自行研制的无血清培养基对培养脐血MSC进行了研究.     

脐带间充质干细胞培养中的染色标记及示踪技术

背景：脐带间充质干细胞的培养是进行脐带间充质干细胞研究时极其重要的部分,细胞培养技术的优化对推动间充质干细胞的临床应用特别是细胞治疗至关重要。同时,脐带间充质干细胞标记及示踪技术是干细胞移植治疗的研究热点之一。目的：对国内外脐带间充质干细胞染色标记技术的研究与进展作一综述。方法：以“干细胞,间充质干细胞,脐带间充质干细胞,细胞培养,染色标记”为中文捡索词,以“Umbilical cord-derived mesenchymalstem cells,Cell culture,Labeling methods”为英文检索词,检索维普和中国知网（CNKI）期刊全文数据库、Medline,highwire和外文生物医学期刊全文数据库（Foreign Journals Integration System）2001年1月至2013年10月有关脐带间充质干细胞的培养及标记染色文献。最终纳入35篇文献进行综述。结果与结论：脐带间充质干细胞尚未得到广泛应用,最关键的原因是脐带间充质干细胞的分离培养及染色技术不是很成熟,这些方面都值得在研究中进一步优化。虽然近几年脐带间充质干细胞标记及示踪技术有了较快的进展,但仍存在许多问题有待进一步解决。     

原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究

背景：如何获得大量稳定活力好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。 目的：通过组织块法、酶消化法和酶解组织块法3种细胞培养方法比较,筛选出最佳的人脐带间充质干细胞的培养方式。 方法：分离新鲜脐带10根,分别采用组织块法、酶消化法、酶解组织块法3种方式培养人脐带间充质干细胞,比较3种方式原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间、细胞培养成功率、绘制细胞增殖曲线,利用流式细胞仪检测细胞表面标志,并进行多项分化能力检测。 结果与结论：酶解组织块培养法原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间与酶消化法无显著差异,但明显短于组织块法（P 〈0.01）,原代人脐带间充质干细胞培养成功率显著高于其他两组,人脐带间充质干细胞增殖情况3组无显著性差异,酶解组织块培养法培养的第3代人脐带间充质干细胞其细胞表面标志及多项分化能力符合间充质干细胞的特性。酶解组织块培养法能缩短原代人脐带间充质干细胞爬出时间,显著提高原代人脐带间充质干细胞的成功率。     

人脐带间充质干细胞超微结构观察

本研究观察脐带间充质干细胞的超微结构。用胶原酶消化法分离培养足月新生儿的人脐带间充质干细胞(hUCMSC),进行传代培养、扩增,在显微镜下观察其细胞形态。对培养至第3代的hUCMSC进行免疫表型测定,进行成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化实验,并在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下进行超微结构的观察。结果表明,hUCMSC外观呈梭形和多角形,并可见细胞核;高表达表面标志CD44,CD73,CD105,不表达CD34,CD45,CD31和HLA-DR;能够进行成脂、成骨、成软骨分化。在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的细胞形态:一种处于静止期,细胞核大,圆或卵圆形,仅有1个核仁,胞质内细胞器少;另一种处于相对活跃期,同一个细胞内可以看到1个或2个细胞核,细胞器数量丰富、结构清晰,并可见扩张的线粒体。结论:从脐带中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性,具有两种不同状态的超微结构。     

无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

于2005-06,2007-09在南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室拟建立一种在无血清培养条件下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的方法.所用无血清培养基血清替代物是将纯化人转铁蛋白直接溶于DMEM培养基金,再将去毒后的BSA、超声波粉碎后的胆固醇、胰岛素及过氧化氢酶直接加入DMEM培养基中稀释至所需浓度.体外分离的脐血单个核细胞以1×109 L-1接种,加入含氢化可的松、纤维连接蛋白的无血清培养基,7d后消化传代.取传至2,5,8代的脐血间充质干细胞,达60%～70%融合时以含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基诱导其向神经细胞分化.结果在无血清条件下能培养扩增出大蕈脐血间充质干细胞,融合后可继续传代扩增;不表达CD34、CD13和CD45,强表达CD166、CD29、CD105.较强表达CD54,80%以上细胞处于G0G1期;脐血间充质干细胞经诱导后,能形成具有典型神经元形态的神经细胞,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白均呈阳性表达.提示在自行研制的无血清培养条件下可成功诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化.     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.     

过氧化氢酶在人脐带间充质干细胞中作用的研究

本研究通过携带过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的逆转录病毒载体转染人脐带组织源间充质干细胞(UC-MSC),探讨CAT对人UC-MSC增殖以及多向分化潜能的影响。将携带绿色荧光蛋白(GFP)空载体质粒pMSCV-GFP和携带CAT基因的pMSCV-GFP-CAT逆转录病毒载体分别转染体外培养的人UC-MSC,用流式细胞仪分析并分选获得MSC-GFP、MSC-GFP-CAT两种细胞株;用过氧化氢酶检测试剂盒检测上述细胞株和UC-MSC中过氧化氢酶活力;用cell counting kit-8检测转染后细胞的增殖能力;用von Kossa和油红O染色观察成骨和成脂定向诱导分化。结果表明:转染48小时后即可观察到UC-MSC发出绿色荧光,3天后达到稳定状态,随着细胞的传代荧光强度不会减弱。流式细胞仪检测GFP+转染率显示,MSC-GFP为(25.54±8.65)%,MSC-GFP-CAT为(35.4±18.57)%;体外传代培养后检测UC-MSC、MSC-GFP、MSC-GFP-CAT细胞CAT活性分别为:19.5、20.3、67.2U;MSC-GFP-CAT能被诱导分化为成骨和脂肪细胞;携带CAT基因载体转染对UC-MSC的增殖无显著影响(p0.05)。结论:成功获得高表达CAT的UC-MSC,其CAT的表达水平为对照组的3.4倍,转染对UC-MSC的增殖和分化能力无显著影响,基因转移使UC-MSC保留了成骨和成脂的能力。     

人脐血树突状细胞体外无血清培养

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,已试用于肿瘤的免疫治疗,但多数实验室培养DC的体系中包含血清,使其临床应用受到限制。本研究以人脐血为来源,建立了无血清培养DC体系,以期将来用于临床。首先,用rhGM-CSF加rhTNF-α,进行有血清液体悬浮培养,14天后,从(1±0.5)×10~4/ml CD34~ 细胞或(5±2)×10~5/ml单个核细胞中,总细胞数扩增5倍,DC分别占(25±5)％和(17±5)％。第二,以无血清培养基代替有血清培养基,培养21天,(2±1)×10~6/ml单个核细胞没有数量的扩增,DC占(7±2)％。最后,对上述培养体系,在第5天(有血清培养基)或第12天(无血清培养基)后加入rhIL-4,DC产率及细胞总数均未增加。本研究结论:①根据液体悬浮培养中观察到粒、巨噬细胞和DC的混合集落及DC小丛,证实DC与粒、巨噬细胞有共同祖先,均来源于CD34~ 造血干/祖细胞;②脐血单个核细胞虽较CD34~ 细胞产生DC的比率稍低,但分离方便,花费少;③无血清体系的培养效果不如有血清体系,培养所需时间也长,细胞产率也低,有待进一步完善;④未证实rhIL-4能增加DC产率。     

人脐带源神经干细胞的培养和分化

目的研究诱导人脐带间充质干细胞(hucMSC)分化为神经干细胞样细胞(hucNSC)的方法。方法体外培养hucMSC,流式细胞仪鉴定细胞表型的表达。用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子添加B27诱导,流式细胞学、免疫细胞化学鉴定。用胶质源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1β(IL-1β)和全反式维甲酸(ATRA)等诱导分化,免疫组化染色、RT-PCR鉴定。结果hucMSC表达CD105、CD44、CD29。诱导后聚集成细胞球悬浮生长,并不断增殖,流式细胞仪鉴定失去hucMSC的表面标志物特征,而表达Nestin、CD133。再经RA、GDNF、IL-1β诱导,细胞表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和酪氨酸羟化酶。结论hucMSC能分化为具有神经干细胞样生长、增殖、分化特征的细胞。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法。从正常产妇分娩后的脐带静脉灌注液分离间充质干细胞,观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期,在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化。结果表明:脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样,高表达CD29、HLA-ABC、CD166、CD105、CD73、CD44;不表达造血和内皮标志(CD34、CD45、CD144和CD14)。它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化,符合间充质干细胞的基本功能特征。结论:人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞,能够在体外培养和扩增,可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞。     

三维培养对脐带间充质干细胞表型及造血因子基因表达的影响

本研究探讨三维立体培养条件下脐带间充质干细胞（UC-MSC）的细胞表型变化及部分造血相关因子的基因表达,为下一步研究三维立体条件下的造血扩增及诱导分化提供基础.从脐带中分离出MSC,分别在二维及三维条件下培养,通过流式细胞术检测MSC表面抗原的表达水平,通过成血管试验比较了两种细胞的成血管能力,并通过实时定量PCR检测两种培养条件下造血相关细胞因子的基因表达情况.结果表明：从脐带中成功地分离出了MSC,在三维培养条件下其内皮细胞、内皮祖细胞和间充质原始干细胞的表面标记CD31、CD133和CD271等阳性细胞百分比显著增加,体外成血管能力增强;骨架蛋白β-actin基因在三维培养条件下表达上调,G-CSF、LIF、SCF、IL-1 α、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等与造血调控有关的细胞因子基因表达也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤为明显;免疫调控相关的细胞因子IL-10的表达也增高,而SDF-1和IL-6的表达虽有轻微的降低,但无显著性差异.结论：三维培养条件下UC-MSC的CD31、CD133和CD271表达上调,体外成血管能力增强,并且多个造血相关因子的基因表达水平上调.     

人脐带组织源间充质干细胞中SDF-1受体CXCR4的表达特征

本研究探讨健康人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)中SDF-1受体CXCR4的表达特征。运用组织块贴壁法从健康人脐带中培养出hucMSC;采用流式细胞术检测hucMSC表面特异性标记;应用油红O染色及茜素红染色对hucMSC成脂和成骨情况进行检测;运用流式细胞术检测第2-第5代hucMSC中CXCR4受体的表达情况,同时采用实时荧光定量PCR法检测第2-第5代hucMSC中cxcr4mRNA的表达。结果表明,hucMSC表现出CD44、CD13、CD71阳性,CD38、CD117、HLA-DR阴性。hucMSC经成脂、成骨诱导后出现脂滴及钙结节,经油红O及茜素红染色均呈阳性。流式细胞术检测显示在第2-第5代hucMSC中均有CXCR4蛋白表达,分别为(89.82±0.62)%、(86.87±1.32)%、(80.50±4.46)%、(70.10±0.68)%。第2-第5代hucMSC中cxcr4mRNA均有表达,且第3-第5代cxcr4mRNA表达量分别为第2代的0.5585±0.0875倍、0.6205±0.1377倍、0...     

人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究

为了对比人脐带组织源间充质干细胞（UC-MSC）与骨髓源间充质干细胞（BM-MSC）的生物学特性,从足月胎儿脐带组织和成人骨髓中分离出间充质干细胞（MSC）。用有限稀释法、流式细胞术、倒置显微镜检及RT-PCR等方法检测UC-MSC和BM-MSC的分离成功率、细胞产量、成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、增殖特性、免疫表型和多向诱导分化能力等并对比性研究二者的生物学特性。结果表明,UC-MSC和BM-MSC的分离成功率均达100%;虽然由脐带组织中分离的有核细胞数低于骨髓（1×10^6/cmvs5.5×10^7/ml）（p=0.0002）,但在培养第14天由脐带和骨髓中得到的贴壁细胞数无差异（8.6×10^5/cmvs8.4×10^5/ml）（p〉0.05）;UC-MSC形态、大多数分子表型、细胞周期状态、脂肪和骨诱导分化能力与BM-MSC相似,但UC-MSC的CFU-F比例（1∶1609±0.18）高于BM-MSC的CFU-F比例（1∶35700±0.01）（p〈0.05）。此外,UC-MSC具有比BM-MSC更强的增殖能力（p〈0.05）。UC-MSCHLA-ABC和CD106分子表达低于BM-MSC（p〈0.05）。结论：脐带组织源间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与BM-MSC的相似,且具有比BM-MSC更高的增殖能力、较低的HLA-ABC和HLA-DR表达,UC-MSC有望成为BM-MSC理想的替代来源。     

异基因脐血干细胞与脐带间充质干细胞联合移植治疗假肥大型肌营养不良症一例的护理

假肥大型肌营养不良又称杜兴肌营养不良（duchenne＇s muscular dystrophy, DMD）,是一种X连锁隐性遗传病,以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征,可同时累及心肌和呼吸肌。DMD目前尚无有效的治疗方法。     

脐带间充质干细胞治疗儿童异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病疗效观察

本研究观察人脐带间充质干细胞（MSC）治疗儿童急性移植物抗宿主病的疗效和安全性。用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗;5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解。2例行亲缘HLA3/6位点相合的骨髓造血干细胞移植,1例行同胞HLA全相合骨髓与外周血造血干细胞联合移植,1例行无血缘关系HLA4/6位点相合双份脐血造血干细胞移植,1例行无血缘关系HLA5/6位点相合单份脐血造血干细胞移植。患儿发生Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病（aGVHD）,接受二线免疫抑制治疗无效后,行0.5×106/kg受者体重MSC治疗。结果表明,5例急性白血病患儿均获造血重建,并发生皮肤、肝脏和胃肠道Ⅲ-Ⅳ度aGVHD,经二线免疫抑制治疗无效,输注人脐带间充质干细胞治疗后,皮疹消退,肝功能恢复正常,胃肠道症状好转。患儿均未发生输注相关不良反应。目前患儿均无原发病的复发,均处于无病生存状态。结论：异基因造血干细胞移植是治疗儿童急性白血病的有效方法,脐带间充质干细胞治疗儿童急性移植物抗宿主病是安全有效的。