小鼠Gtf2h2基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆小鼠Gtf2h2基因并使其在真核细胞HEK293中稳定表达?方法:采用小鼠卵母细胞cDNA为模板,经PCR扩增Gtf2h2后,利用新型In-Fusion分子克隆体系将该目的片段克隆至真核表达载体pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-mKate中?所得阳性克隆的质粒DNA在经限制性酶切电泳和测序鉴定克隆成功后,转染到HEK293细胞中进行表达?表达效果利用抗DDK和mKate标签的抗体通过免疫荧光以Western blot 的方法进行检测?结果:质粒DNA测序和酶切鉴定证明Gtf2h2基因克隆成功;Western blot 检测到GTF2H2-3DDK和GTF2H2-mKate融合蛋白在转染后的HEK293细胞内的表达;免疫荧光显示融合蛋白在转染后的HEK293细胞核内定位并呈颗粒状分布?结论:成功克隆了小鼠Gtf2h2基因并实现了其在真核细胞HEK293中的稳定表达,为进一步研究其功能和作用机制奠定了基础?     

ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达

目的 构建重组表达载体ARRB1-EGFP,在细胞中表达与鉴定,为进一步研究其功能奠定基础.方法 RT-PCR获得编码人ARRB1的全基因序列,克隆到真核表达载体pEGFPN1,构建重组表达载体ARRB1-EGFP,并转化于E.coli DH5 α中筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转染人HEK293细胞中表达,表达产物经Western blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光方法比较融合蛋白与内源性ARRB1在SNB19细胞的定位.结果 成功构建了ARRB1融合蛋白的真核表达载体,并经Western blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白与内源性ARRB1定位相似.结论 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地转导入HEK293以及SNB19细胞中.     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立

目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。     

人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

目的 克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位.方法 通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cD-NA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pC-MV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T 细胞,Western blot 检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位.结果 经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调.激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质.结论 GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质.     

人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

pCMV －Myc －MyD88重组质粒构建及其在293 T细胞中的表达

目的：构建髓样分化因子88（MyD88）真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为进一步研究应用奠定实验基础。方法从大鼠肝星状细胞株T－6中提取总RNA,应用PCR技术扩增MyD88基因编码序列片段,克隆入真核表达载体pCMV－Myc质粒中,对重组质粒经酶切和测序鉴定后,以钙离子转染法转染至293T细胞中,采用Western blot的方法检测MyD88蛋白的表达,以观察转染及表达效果。结果酶切及测序结果证明pCMV－Myc－MyD88重组质粒的DNA序列正确,将其转染至293T细胞后,MyD88蛋白表达明显增加。结论pCMV－Myc－MyD88重组质粒构建成功,并能在293T细胞中表达,为进一步研究针对MyD88分子的疾病治疗及其生物学功能奠定了实验基础。