豚鼠耳蜗毛细胞钙调蛋白的表达

目的：研究正常生理状态下钙调(calmodulin)的结构特征和分布规律。方法：本研究应用免疫细胞化学方法，采用单克隆抗体及免疫荧光标记技术，借助于荧光显微镜和激光扫描共聚集显微镜，逐层观察耳蜗钙调蛋白的分布特点。结果：豚鼠耳蜗外毛细胞（OHCs)和内毛细胞（IHCs)各转之间calmodulin分布无变化，OHCs内calmodulin含量多于IHCs。OHCs表皮板和静纤毛出现calmodulin特异性着色，表明哺乳动物耳蜗OHCs的静纤毛含有calmodulin。支持细胞内无calmodulin的分布。结论：豚鼠耳蜗OHCs,IHCs和支持细胞中calmodulin的3结构和分布有显著差异。     

庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞破坏后再生及功能恢复

为探讨哺乳动物前庭毛细胞破坏后能否再生及前庭功能能否恢复，以豚鼠为研究对象。实验组动物每日给予庆大霉素皮下注射，连续１０天，对照组动物给予等量生理盐水。于停药后的第２、４、１２和２４周分别处死动物，扫描电镜观察发现，停药２周椭圆囊和壶腹嵴毛细胞破坏最明显的区域可见到不成熟的毛细胞纤毛丛，至停药２４周后继续存在。与对照组相比，停药１２周毛细胞密度下降明显（Ｐ〈０．０１），停药后２４周时毛细胞密度较１     

豚鼠冲击波负压暴露后耳蜗毛细胞损害定量观察

目的 探讨冲击波负压（blast underpressure,BUP）暴露后豚鼠耳蜗毛细胞损害特点.方法将豚鼠暴露实验性BUP 14天后处死,硝酸银染色硬铺片法计数观察耳蜗基底膜毛细胞损伤情况.结果压力峰值介于-22.4kPa和-63.3kPa之间的实验性BUP暴露后,豚鼠耳蜗外毛细胞出现了明显的病理性改变,损伤的程度以第二转最重,第二排和第三排的病变比第一排更为严重.BUP强度越高,毛细胞损害越重.各实验组动物的外毛细胞总缺失率明显高于正常对照组（P＜0.01）;重复暴露3次的动物外毛细胞缺失率明显高于暴露1次的动物（P＜0.01）.结论BUP暴露可引起明显的豚鼠耳蜗外毛细胞缺失等损害,其损害程度与负压峰值及暴露次数密切相关;毛细胞损害越重,ABR阈移也就越明显.     

庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞破坏后再生及功能恢复

为探讨哺乳动物前庭毛细胞破坏后能否再生及前庭功能能否恢复，以豚鼠为研究对象。实验组动物每日给予庆大霉素（１５０ｍｇ／ｋｇ）皮下注射，连续１０天，对照组动物给予等量生理盐水。于停药后的第２、４、１２和２４周分别处死动物，扫描电镜观察发现，停药２周椭圆囊和壶腹嵴毛细胞破坏最明显的区域可见到不成熟的毛细胞纤毛丛，至停药２４周后继续存在。与对照组相比，停药１２周毛细胞密度（毛细胞数／１００μｍ基底膜长度）下降明显（Ｐ＜０．０１），停药后２４周时毛细胞密度较１２周明显上升（Ｐ＜０．０５），但仍未达到正常水平（Ｐ＜０．０５）。另取豚鼠按上述方法进行庆大霉素注射，于注射前和停药后４、１２和２４周进行冰水诱发眼震电图检查，可见停药４～１２周平均慢相眼震速度（Ｖｍｅａｎ）明显下降（Ｐ＜０．０１），停药２４周后Ｖｍｅａｎ有明显恢复（Ｐ＜０．０５），但仍未达到正常水平（Ｐ＜０．０１）。提示：豚鼠周围前庭功能破坏后可以部分恢复，前庭毛细胞破坏后可以修复，其功能的恢复可能源于毛细胞再生。     

丁胺卡那霉素诱发豚鼠耳蜗外毛细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗时外毛细胞凋亡现象及其凋亡发生特点。方法 用一定剂量的丁胺卡那霉素对15只豚鼠行耳蜗造模后利用光镜、TUNEL标记技术（teminal-deoxynucl eotidy transferase mediated d-UTP nick-end labeling)原位检测凋亡发生。结果 肌注丁胺卡那霉素1d后即可诱发豚鼠蜗底转外毛细胞发生凋亡,随着用药时间延长,其余各转外毛细胞亦发生凋亡,甚至出现部分外毛细胞丢失现象。结论 氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗系统时可引起外毛细胞凋亡,细胞凋亡是豚鼠耳蜗听毛细胞损伤的一条途径;氨基糖苷类抗生素耳毒性作用机制可能与其引起耳蜗毛细胞凋亡有关。     

谷氨酸调节耳蜗内毛细胞游离钙的实验观察

目的 探讨谷氨酸（glutamate,Glu）对离体耳蜗内毛细胞（inner hair cells,IHC)内钙信号的调控作用及其生理病理意义。方法 在激光共聚焦显微镜下用钙敏荧光探针Fluo－3作为指示剂,观察外源性谷氨酸对分离的10个豚鼠耳蜗IHC胞内游离钙离子浓度（[Ca^2 ]i)的影响。结果 分离好的正常IHC呈烧瓶形态,有明显的颈部,皮板上可观察到静纤毛,大球形的细胞体中间可见圆形的细胞核。形态完好的IHC大约存活2h,Fluo-3 钙敏荧光探 针染色后IHC胞体、胞核及表皮板有明显的染色梯度,表明游离Ca^3 浓度从细胞 核向细胞逐渐减少。终浓度为3.85umol/L的Glu对游离IHC内[Ca^2 ]i有增高趋势,而对游离外毛细胞（outer hair cells,OHC)内[Ca^2 i]浓度无影响。观察10个IHC,发现9个[Ca^2 ]i浓度增加,1个无变化;观察10个OHC,发现7个[Ca^2 ]i无变化,3无略有下降。当Glu浓度增高后,IHC内[Ca^2 ]i先是迅速升高,继而逐渐下降,IHC外形由烧瓶状逐渐变成球形,提示IHC水种变性。结论 Glu可选择性调控IHC内[Ca^2 ]i ,而对OHC内[Ca^2 ]i无影响,而过量的Glu刺激,可造成IHC[Ca62 ]i的堆积,从而IHC水肿变性。     

硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流作用的实验研究

OBJECTIVE: To study the effects and mechanism of sodium nitroprusside (SNP), a donor of nitric oxide, on the calcium currents of isolated outer hair cells (OHCs) from the cochlear of guinea pigs. METHODS: Acute isolated outer hair cells of guinea pigs were performed, and the whole cell patch clamp recording techniques were used. The K+, Na+ ions were excepted to study effects of SNP on the calcium currents of outer hair cells. RESULTS: SNP inhibited the inward calcium currents of OHCs. Under the condition of holding at -60 mV and stimulation voltage as +10 mV, SNP (10 mmol/L) inhibited (61.12 +/- 1.99)% of the whole cell's calcium currents (n = 5). A dose-reaction response was obtained from 5-8 cells. The half inhibiting concentration was 1.9 mmol/L while the maximum inhibiting concentration was 100 mmol/L, but Hill coefficient was 0.98. SNP could selectively block the L-type calcium channels on outer hair cells (n = 6). CONCLUSION: As a donor of nitric oxide, SNP could affect the physiology function of outer hair cells by inhibition of the calcium currents by blocking the L-type calcium channels.     

庆大霉素和卡那霉素耳中毒后雏鸡耳蜗毛细胞的再生

给２天龄纯种罗丝鸡分别肌注庆寺霉素（ＧＭ）和卡那霉素（ＫＭ）１０天，于停药当天、第１、２、３和４周处死小鸡，取出内耳基底乳头（ＢＰ）用扫描电镜和光镜观察，发现从ＢＰ的基底到中部有广泛性损害，毛细胞损失率约占４０％，在１周后受损部位表皮板上出现丛生的有微绒毛的再生毛细胞，随恢复期延长，再生毛细胞表面积增大，动纤毛和静纤毛束长出，３至４周受损部位已完全被发育成熟的再生毛细胞填补，ＢＰ形态恢复。     

庆大霉素和卡那霉素耳中毒后雏鸡耳蜗毛细胞的再生

给２大龄纯种罗丝鸡分别肌注庆大霉素（ＧＭ）和卡那霉素（ＫＭ）１０天，于停药当天、第１、２、３和４周处死小鸡，取出内耳基底乳头（ＢＰ）用扫描电镜和光镜观察，发现从ＢＰ的基底到中部有广泛性损害，毛细胞损失率约占４０％，在１周后受损部位表皮板上出现丛生的有微绒毛的再生毛细胞，随恢复期延长，再生毛细胞表面积增大，动纤毛和静纤毛来长出，３至４周受损部位已完全被发育成熟的再生毛细胞填补，ＢＰ形态恢复。     

铅暴露对豚鼠耳蜗毛细胞损害的定量分析

目的研究铅暴露浓度与豚鼠耳蜗毛细胞形态学改变和对听觉系统损害程度的量化关系。方法50只豚鼠分为对照组和实验组。对照组(10只)豚鼠腹腔注射生理盐水1ml,隔日一次。实验组分为两组:高铅组(20只):豚鼠腹腔注射0.25%醋酸铅溶液40mg/kg;低铅组(20只):豚鼠腹腔注射0.25%醋酸铅溶液20mg/kg,分别于停药后7、14、28天采血。断头后行全耳蜗铺片的光学和电镜检查。结果腹腔注射醋酸铅后,血清中铅含量迅速升高。低铅组铅暴露1周后出现外毛细胞损害;高铅组铅暴露2周后外毛细胞损害程度较重,出现细胞变性、减少、结构不清,电镜观察可见毛细胞缺失明显;高铅暴露4周后毛细胞损害呈进行性加重。结论铅暴露对豚鼠耳蜗毛细胞损害明显,表现为纤毛的散乱、倒伏、部分脱落、大片缺失等,其损害程度与铅暴露浓度呈正相关性。     

手机微波辐射对豚鼠耳蜗外毛细胞膜电位的影响

目的探讨手机微波辐射对豚鼠耳蜗外毛细胞膜电位的影响。方法取成年豚鼠20只随机分为对照组和辐射组,每组各10只。对照组不做任何处理;辐射组:距豚鼠右侧耳廓2cm处对辐射组豚鼠进行手机微波辐射,辐射时间分别为1、6、12、24和48h,然后分别于各时间点随机活杀两组中的豚鼠各2只,取出听泡,分离耳蜗外毛细胞,用2 000Hz纯音进行不同强度的声刺激,观察离体单个外毛细胞(OHC)膜电位的变化特征。结果对照组离体单个OHC予2 000Hz、10dB HL纯音刺激时,于第40s细胞内荧光值开始升高,并于第50s达到峰值(1.112u),随后细胞内荧光值开始回落,于第60s至最低值(1.000u)。辐射组微波辐射1小时后,OHC细胞膜的去极化和复极化时间明显增加,并且不能完全去极化和复极化;辐射6和12h后,随着间断的声刺激可见OHC内荧光值缓慢上升,辐射6小时组之毛细胞于第70s荧光值达峰值(1.100u),而辐射12小时组之毛细胞于第90s荧光值达峰值(1.050u),随后整条曲线呈微上升趋势;辐射24和48h后,经过声刺激,曲线呈微上升、微下降波动,无明显峰值及回落。结论长时间的手机微波辐射能导致离体豚鼠耳蜗OHC膜离子通透性的改变,影响OHC膜电位的形成及细胞去极化、复极化,从而导致离体OHC膜电位对不同强度纯音刺激的敏感性逐渐降低。     

外源性谷氨酸对豚鼠耳蜗内、外毛细胞易损性的比较

目的观察外源性谷氨酸对豚鼠耳蜗电位及耳蜗内、外毛细胞的影响。方法将健康豚鼠30只随机分为3组,应用豚鼠全耳蜗灌流技术,分别经耳蜗灌流人工外淋巴液和不同浓度的谷氨酸2小时,记录灌流前和灌流后的耳蜗电位(CM、CAP);同时应用透射电镜技术观察灌流前后耳蜗形态学的变化。结果灌流人工外淋巴液后豚鼠耳蜗电位及形态学无改变;灌流10 mmol/L谷氨酸后CM幅度虽有下降,其非线性特点无改变,CAP阈值平均升高了35 dB;灌流20 mmol/L谷氨酸后CM幅度明显下降但仍保持其非线性特点,CAP阈值平均升高了48 dB,灌流谷氨酸后耳蜗内毛细胞及传入神经纤维出现空化。结论谷氨酸是耳蜗主要的兴奋性传入神经递质,应用外源性谷氨酸可以引起耳蜗内毛细胞及传入神经的损伤,但对耳蜗外毛细胞无影响。     

谷氨酸／天冬氨酸转运体抗体对豚鼠听性脑干反应及毛细胞形态的影响

目的 研究谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate--aspartate transporter,GLAST)抗体对豚鼠耳蜗听性脑干反应(ABR)和耳蜗毛细胞形态的影响.方法 健康豚鼠20只随机分为实验组和对照组,每组10只.实验组耳蜗鼓阶内灌注GLAST抗体,对照组灌注人工外淋巴液,观察两组术后3、6、9天ABR反应阈、耳蜗基底膜铺片和透射电镜的形态学改变.结果 实验组术后第3天ABR波形消失,术后第9天无恢复;对照组术后第3天8只动物ABR波形消失,术后第6天和第9天全部动物引出ABR波形,平均阈值分别为62.50±5.25、47.50±6.18dB SPL,差异有统计学意义(P<0.05).随着GLAST抗体灌注后时间延长,实验组内、外毛细胞及纤毛出现不同程度缺失,透射电镜显示内、外毛细胞及神经末梢胞浆、线粒体空化,细胞核染色质边集等凋亡早期征象.对照组的损伤较轻,与ABR阈值改变相一致.结论 耳蜗内GLAST抗体灌注后出现耳蜗毛细胞、神经末梢的损伤及ABR波形消失,提示GLAST抗体阻断耳蜗Corti器中的GLAST,导致谷氨酸的神经毒性表达.     

头低位模拟失重状态对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响

目的探讨头低位模拟失重对豚鼠耳蜗听功能与超微结构的影响。方法 22只豚鼠随机分为实验组16只和对照组6只。实验组采用头低位模拟失重法,身体纵轴与水平线呈-30°,于实验前、失重5天后即刻及脱离失重3天后分别测试豚鼠听性脑干反应(ABR),然后取耳蜗行扫描电镜和透射电镜观察。对照组不作任何处理。结果对照组豚鼠ABR反应阈为23.48±6.04dB SPL,实验组实验前为24.22±4.04,模拟失重5天后即刻ABR反应阈为41.61±7.01dB SPL,与实验前和对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.05);脱离失重3天后实验组ABR反应阈为27.50±3.54dB SPL,与实验前相比差异无显著统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察发现失重5天后即刻豚鼠耳蜗内、外毛细胞散在缺失,纤毛融合、倒伏;透射电镜检查见内、外毛细胞细胞局部空泡形成,脱离失重3天后上述病变均有明显恢复,但未完全恢复正常。结论模拟失重5天即可以导致豚鼠耳蜗听觉功能和超微结构的损伤,脱离失重3天后听功能可以恢复正常,但其超微结构还没有完全恢复正常。