改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：改良大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）原代分离方法,探讨大鼠MSCs体外培养的适宜条件。方法：比较改良与传统单纯贴壁培养法、密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠MSCs,观察不同方法获得原代细胞形态及不同代MSCs的生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记,同时观察不同浓度的胎牛血清（FBS）对MSCs生长曲线的影响。结果：改良单纯贴壁培养法获得的原代细胞贴壁时间早、生长快,与其他两种分离方法差异明显（P〈0.01）;原代MSCs用15％的FBS培养,其增殖明显高于5％、10％及20％的FBS培养;第3代以后MSCs用5%的FBS培养有力于细胞纯化。结论：成功地改良了分离培养大鼠MSCs的方法,配合不同血清浓度培养基可使收获MSCs效率增高。     

人骨髓间充质干细胞的培养及细胞增殖测定

目的 分离培养并鉴定人骨髓间充质干细胞.方法 成人骨髓取自非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性的胸外科手术中摘取的肋骨,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原.结果 人骨髓间充质干细胞(MSCs)的CD44表达阳性;早、中、晚3代传代培养具有以下共性特征:传代培养潜伏期约为24～36 h;传代培养对数增殖期约为4～6 d;对数增殖期结束后至接种后第9 d,MSCs生长逐渐缓慢,进入平台期.结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外培养的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞体外培养的可靠方法.方法 采用人手术切下的骨头标本,运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs;观察并绘制生长曲线;取生长状态良好的第四代细胞,通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物等鉴定hBMSCs;诱导hBMSCs分化为成脂肪细胞,鉴定本实验所分离的hBMSCs是否具有多向分化能力.结果 第四代细胞CD29和CD44阳性表达率分别为100%和99.8%,CD31和C1345阳性表达率分别为0.8%和0.4%.流式细胞仪检测证明本研究分离培养hBMsCs的方法可以获得高纯度的间充质干细胞.hBMSCs体外诱导向脂肪细胞分化16d后,镜下可见胞浆内充满圆形脂滴,油红O染色阳性,诱导成脂肪细胞分化率为85.1±3.2%,证实本实验分离的IiBMSCs具有多向分化能力.结论 采用手术切下的骨性关节炎标本,运用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的hBMScs,并具有多向分化能力.本方法能为临床上分离、培养入骨髓间充质干细胞提供了另一种可靠的路线.     

三维和二维培养的脐带间充质干细胞DNA甲基化水平比较

目的 探讨三维培养对脐带间充质干细胞(UC-MSCs)全基因组DNA甲基化状态的影响。 方法 通过贴壁培养法获得UC-MSCs,采用流式细胞术鉴定其细胞表型。采用聚氟乙烯巢状片进行三维培养,吖啶橙荧光观察UC-MSCs在支架上生长情况。采用甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)技术检测细胞全基因组DNA甲基化情况。 结果 成功分离培养UC-MSCs并证明其表型符合国际标准,细胞黏附在聚氟乙烯巢状片三维培养体系中且生长良好。MeDIP-Seq结果显示,三维培养后UC-MSCs全基因组DNA甲基化水平较二维培养整体上调。基因本体(GO)分析显示,与二维培养的细胞相比,三维培养的UC-MSCs中上调的差异甲基化基因多参与蛋白质的代谢、膜相关细胞器的组成、酶活性调节等;而下调的差异甲基化基因主要参与囊泡运输和cGMP代谢过程。通路分析显示,三维培养的UC-MSCs中上调的差异甲基化基因多参与RNA转运、神经配体受体活性、Notch信号通路等;下调的差异甲基化基因多参与磷酸肌醇代谢通路和囊泡分泌相关的通路。 结论 三维培养改变了UC-MSCs的DNA甲基化谱,所涉及的甲基化上调基因多参与细胞的迁移和增殖功能。三维培养降低了UC-MSCs的免疫调控和分泌囊泡相关基因的甲基化水平。     

人牙髓干细胞体外二维和三维培养的实验研究

目的分离人牙髓干细胞并在体外进行二维和三维培养.方法从健康成人拔除的第二前磨牙获得牙髓,酶消化法分离获得牙髓干细胞,并进行鉴定.体外对牙髓干细胞在二维和三维空间里进行培养,并比较其增殖效率.结果人牙髓干细胞在体外呈克隆样生长,诱导条件下可向肌细胞和成牙本质细胞方向分化.在二维空间里培养,细胞密度提高了4.12倍,而在三维空间里培养,细胞密度提高了11.06倍.培养后细胞生物学特性未发生改变.结论成功地从人第二前磨牙中分离到了牙髓干细胞;三维培养是扩增牙髓干细胞的有效方法.     

骨髓间充质干细胞多向分化的研究

干细胞是体内存在的一类特殊细胞,既能自我更新又能多向分化。骨髓间充质干细胞作为干细胞中的一种,可分化成多种具有特定功能的细胞,并且证实其可分化为多种组织细胞参与组织损伤的再生和修复。     

运用组织工程学原理构建间充质干细胞的三维培养体系

目的　探讨普通重力和模拟微重力条件下构建人间充质干细胞的三维培养体系。方法　将人间充质干细胞和人发角蛋白共同置于普通重力和模拟微重力条件下进行培养。结果　当转速为 37.2r min时 ,人发角蛋白在旋转式细胞培养系统中呈悬浮状态 ,沿一条与氧交换膜的轴心垂直的环形轨道随液体流转动 ,1× 10 3个 ml的人间充质干细胞和人发角蛋白共培养 7d ,在模拟微重力条件下有较多的间充质干细胞贴附生长于人发角蛋白表面 ,密集、平行排列 ,细胞在人发表面几乎形成密集的一层 ,在普通重力条件下人发角蛋白表面生长的间充质干细胞较稀疏 ,大多呈多角形。结论　普通重力和模拟微重力条件均适合于间充质干细胞的三维培养 ,而后者更有利于人间充质干细胞的三维培养体系的构建     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs)。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养、鉴定。应用免疫组化法和流式细胞术评估实验结果。结果:骨髓间充质干细胞易于培养,扩增明显。结论:骨髓间充质干细胞取材方便易于诱导,作为种子细胞具有良好的应用前景。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记。结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形。结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的建立骨髓问充质干细胞（MSCs）体外分离纯化的方法,探索MSCs体外培养的最佳方法,为细胞工程学提供细胞来源。方法①MSCs的分离、培养：在无茵条件下取3．4周龄Wistar雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞,采用裂解红细胞后的贴壁培养法分离MSCs,利用MSCs与其他贴壁细胞的贴壁差异性,严格控制传代时酶的量和消化时间,传代纯化MSCs;②MSCs的鉴定：取第4代（n）MSCs,用免疫荧光染色的方法检测MSCs的表面抗原CD44、CIM5和CDg0。结果①采用裂解红细胞分离骨髓细胞得到的骨髓单个核细胞形态较多样,分布不均,含杂细胞多,随挟液和传代次数增多,细胞纯度提高,n后细胞形态一致,分布均匀,几乎不见杂细胞;②免疫荧光染色结果显示：P4代MSCs经加入一抗、二抗及荧光染料后见CD44、CD90染色呈阳性,CIM5染色呈阴性反应。结论采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离、纯化MSCs,可得到活性和纯度均较好的MSCs。     

人骨髓间充质干细胞全细胞钙离子通道电生理实验研究

目的:探讨入骨髓间充质干细胞钙离子通道的电生理学特性.方法:采用梯度离心法和单层贴附培养法分离,纯化,获取人骨髓间充质干细胞,并对所获取的P1～P2代骨髓间充质干细胞的钙离子通道进行全细胞膜片钳的记录与分析.结果:在骨髓间充质干细胞膜上可记录到对Nicardipine敏感的钙离子通道电流,在阻断膜上钠、钾电流后,当钳制为-90mV,膜上钙电流可被连续记录,从-110～-10mV持续钳制用10mV阶跃去极化,在-60mV获得钙离子通道的反转电流.结论:骨髓间充质干细胞膜上用全细胞膜片钳可记录到钙离子通道电流,其电生理学特性符合非兴奋细胞膜上的钙离子通道特点.     

支架荷载的骨髓间充质干细胞的分化实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架上向表皮干细胞分化的可行性。方法体外诱导改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠骨髓间充质干细胞向表皮干细胞分化,免疫组织化学法检测表皮干细胞标志物CK19和整合素β1的表达。结果诱导液作用2周后,免疫组织化学法检测到改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs中大量阳性双表达CK19和整合素β1。结论改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs仍具有向表皮干细胞分化的潜能,此支架具备作为组织工程皮肤支架材料的条件。     

骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞的蛋白质组学比较

目的采用蛋白质组学的方法比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)和视网膜色素上皮细胞(RPE)中蛋白表达的差异。方法对BMSCs和RPE细胞采用2D-DIGE双向电泳技术获取差异的蛋白点,并对其进行MAL-DI-TOF-MS分析、鉴定,相应蛋白数据库信息检索和功能分析。Western Blot对其中2种差异蛋白进行验证。结果在BMSCs和RPE细胞鉴定出31个差异表达蛋白,其中BMSCs细胞有23种蛋白表达明显上调(主要包括SPARC、PCNA、HSP27),RPE细胞有8种蛋白表达明显上调(主要包括TBP),建立了BMSCs与RPE细胞的差异表达蛋白谱。Western Blot实验进一步验证了蛋白质组学结果。结论 SPARC、PCNA、HSP27、TBP蛋白在BMSCs和RPE细胞中具有明显表达差异,为进一步研究BMSCs诱导分化为RPE细胞提供了基础数据。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退变的研究进展

颈腰背痛是骨科的一种常见病、多发病,引起这些病症的一个重要因素是椎间盘退变[1].椎间盘具有维持脊柱纵轴稳定性、保持脊柱活动范围的功能[2].随着年龄增长,椎间盘在体积、形状、结构、组成及生物力学等方面不断发生变化[3].