耐受有机溶剂洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶酶学性质

一株对多种有机溶剂具有良好耐受能力的产脂肪酶菌株ZYB002经分子鉴定为洋葱伯克霍尔德菌。其产生的细胞结合脂肪酶最适温度为65°C,最适pH为8.0,在低于70°C和pH3-8.5的范围内,全细胞脂肪酶保持稳定。Ca2+、K+、Na+和NO3-等离子对脂肪酶活性有激活作用,而Zn2+有抑制效应。全细胞脂肪酶对正丁醇有较强的耐受能力,但曲拉通X-100对脂肪酶活性有强烈的抑制效应。洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶良好的碱稳定性、热稳定性和有机溶剂耐受性,表明该全细胞脂肪酶具有重要的工业应用潜力。     

粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表达和酶学性质的研究

目的:克隆粘质沙雷氏菌脂肪酶基因(lipA)使其在大肠杆菌B121(DE3)中实现高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以产脂肪酶粘质沙雷氏菌总DNA为模板,PCR扩增脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体pET-lipA,并将其导入大肠杆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质的测定.结果:经过优化培养条件,脂肪酶活力最高能达到104U/mL.重组脂肪酶的最适反应温度为40～45℃,最适pH为7.0～7.5,在50℃保温1h下仍能保持80%的酶活力,Ca2+、Sr2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶酶活有较强的激活作用,尤其是Ca2+使脂肪酶酶活提高了1倍多,而Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+对酶活具有较强的抑制作用,尤其是Zn2+和Al3+使酶活力几乎完全丧失.该酶对一些有机溶剂有较好的耐受性,与50%甲醇混合24h,仍能保持84%的酶活力.结论:该脂肪酶具有较好的热稳定性和甲醇耐受力,作为生产生物柴油的催化剂具有很大的应用价值,为基因工程酶法生产生物柴油打下良好的基础.     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析

为了研究荧光假单胞菌中短链脱氢酶的生理角色和催化特性,从荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GIM1.49基因组DNA克隆表达了一个短链脱氢酶的编码基因pfd,并分析了该基因产物的酶学性质。基因pfd全长684 bp,编码227个氨基酸,推算分子量为24.2 kDa。将携带短链脱氢酶基因的重组质粒pET28b-pfd转入大肠杆菌BL21(DE3) 进行表达,得到了28 kDa的表达产物。重组荧光假单胞菌短链脱氢酶 (PFD) 能氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯、1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-溴-苯乙酮、4-溴-苯乙酮等底物。以4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物时活力最高,Km值为186.90 mmol/L,Vmax为89.56 U/mg。氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯时,最适反应温度和pH分别为12 ℃和10.5,倾向于利用NAD+作辅酶;而还原4-氯-乙酰乙酸乙酯时,最适温度和pH为24 ℃和8.8,倾向于利用NADPH作辅酶。重组PFD能耐受50％ (V/V) 的甲醇等有机助溶剂,Ca2+ (1 mmol/L) 和EDTA (5 mmol/L) 对其酶活有一定的促进作用。上述结果表明,重组PFD是一个新型的短链脱氢酶,其代谢角色推测与卤代次级醇的氧化降解有关。     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从云南省富油地采取了60份土样中,利用透明圈法筛选出一株耐热脂肪酶产生菌。对其酶学性质和发酵条件进行了研究,酶学性质表明,该酶最适作用温度为50℃,最适pH6.0,在pH3.0-8.0范围内稳定,在60℃保温60 min酶活还保留70%;70℃保温60 min残余50%;具有良好的热稳定性;不同金属离子有不同的作用,Ca+,K+对酶有激活作用,Fe3+、Pb2+、Mn2、Cu2+、Al3+、Zn2+对酶活有抑制作用。EDTA对酶影响不大。产酶最佳条件为:MgSO4.7H2O 0.05 g,K2HPO40.1 g,CaCO30.25 g,可溶性淀粉2.5 g,大豆粉2.5 g,装液量50 mL。这株细菌通过培养基优化酶活达到20.3 U/mL。     

海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆、表达及酶学性质

海栖热袍菌(Thermotoga maritima)是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值.由于海栖热袍菌苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低.通过PCR方法克隆编码T. maritima MSB8葡萄糖异构酶基因xylA,构建重组质粒pHsh-xylA,转入Escherichia coli JM109,通过热激诱导表达.通过热处理和离子交换层析纯化两步得到电泳纯的酶制品,纯化倍数和回收率分别为8.02和49.02.对酶学性质研究表明,该重组酶为金属离子激活性酶,Mg2 ,Co2 对相对酶活有很强的激活作用,其最适pH为7.0,最适反应温度为95℃,且在pH 6～8之间有着较好的稳定性,在95℃下半衰期长达5 h以上.以葡萄糖为底物时的表观Km和Vmax分别为105 mmol/L和45.2 mol/min·mg.     

丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate format-lyas,PFL）是厌养或兼性厌养微生物中,代谢途径的关键酶之一,为了进一步研究其功能,我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因,为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上,将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(＋)中,重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过SDS-PAGE电泳分析,在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化,对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明：此酶的最适温度为35 ℃,最适pH为7.5,米氏常数Km＝2.3mmol,Tm＝49.9℃。     

响应面法优化有机溶剂极端耐受性菌株Burkholderia sp．ZYB002产脂肪酶条件

Burkholderia sp．脂肪酶具有较高的有机溶剂耐受性和转酯活性,广泛应用于手性化合物的拆分。本研究利用统计学方法对一株具有有机溶剂极端耐受性的脂肪酶高产茵株Burkholderia sp．ZYB002在摇瓶培养条件下产脂肪酶条件进行了优化。通过单因素实验,首先确定了最适碳源、氮源、诱导荆等。以Plackett—Burrman设计筛选影响Burkholderia sp．ZYB002产酶的主要因素,通过最陡爬坡实验和响应面分析法确定产酶最适条件。K2HP04、大豆油乳化液和起始RH确定为影响菌株产酶的3个主效因素。最佳产酶条件为：糊精0．3％（W／V）,牛肉膏2．0％（W／V）,MgSO4．7H2O．075％（W／V）,K2HPO4 0．14％（W／V）,大豆油乳化液4．89％（V／V）,pH8．11,玻璃珠10颗／瓶,接种量2．0％（V／V）,30℃,250r／min,发酵时间22h。在此条件下,发酵液脂肪酶酶活最高达45．6U／mL,较发酵基本培养基发酵液的脂肪酶酶活提高了3．44倍。     

理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体

【目的】借助蛋白质工程技术提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA的热稳定性,以期更好地将其应用于工业生产中。【方法】利用YASARA、Fold X、Rosetta、Gromacs等生物信息学软件,构建1个脂肪酶Lip A的热稳定性提高的微型突变体电子文库;通过对突变体的结构信息和自由能变化进行评估,筛选出潜在的有价值的突变体。继而利用基因定点突变技术,构建上述候选突变体的突变基因文库,通过实验筛选出热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。【结果】利用上述方法,从构建的20个脂肪酶LipA突变体中,筛选到热稳定性有显著提高的3个突变体LipA-Asn~(125)Asp、LipA-Asn~(125)Glu和LipA-Gln~(262)Glu。经55°C处理12 min后,上述3个突变体的T1250值较野生型分别提高4.0°C、5.5°C和4.4°C;在55°C下的半衰期较野生型分别提高了2.2倍、3.8倍和2.6倍。【结论】利用生物信息学软件,构建脂肪酶LipA突变体电子文库,结合蛋白质的结构信息,可以快速筛选到热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。     

Cloning, expression and characterization of L-cysteine desulfhydrase gene from Pseudomonas sp. TS1138

L-cysteine desulthydrase (CD) plays an important role in L-cysteine decomposition.To identify the CD gene in Pseudomonas sp.TS 1138 and investigate its effect on the L-cysteine biosynthetic pathway,the CD gene was cloned from Pseudomonas sp.TS 1138 by polymerase chain reaction (PCR) method.The nucleotide sequence of CD gene was determined to be 1,215 bp,and its homology with other sequences encoding CD was analyzed.Then the CD gene was subcloned into pET-21a(+) vector and expressed in Escherichia coli (E.coli) by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducement.The recombinant CD was purified by Ni-NTA His-Bind resin,and its activity was identified by the CD activity staining.The enzymatic properties of the recombinant CD were characterized and its critical role involved in the L-cysteine biosynthetic pathway was also discussed.     

一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1菌株γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh 的克隆、表达及酶学性质

【目的】γ-丁基甜菜碱羟化酶是生物体内合成L-肉碱的关键酶。从假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1中克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为生物转化生产L-肉碱奠定基础。【方法】通过PCR克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET-15b;表达产物经His.Bind Resin纯化后对BBH进行酶学性质及三维空间结构分析;并以静止细胞进行L-肉碱的转化。【结果】成功地克隆了一个γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh(GenBank:JQ250036),并实现了其在E.coli中的高效表达。融合蛋白以同源二聚体的形式存在,单个亚基的分子量约46.5 kDa,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。该酶在45℃以下稳定。在pH6.0时该酶有最高的pH稳定性。以表达bbh基因的重组大肠杆菌静止细胞转化L-肉碱,L-肉碱产量可达12.7mmol/L。【结论】Pseudomonas sp.L-1γ-丁基甜菜碱羟化酶与现有报道的bbh基因有较大的差异。由该基因表达的γ-丁基甜菜碱羟化酶能有效地转化γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱。本研究不仅丰富了γ-丁基甜菜碱羟化酶基因资源,而且为L-肉碱的生物转化提供了一种新的转化方案。     

嗜热脂肪地芽孢杆菌NAD激酶克隆表达及酶学性质研究

NAD激酶能催化NAD生成NADP。本研究采用PCR技术从嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组中获得NAD激酶基因,以pET30a（＋）为表达载体、E．coliBL21（DE3）为宿主菌,实现其在大肠杆菌中异源表达,并进行酶学性质研究。结果显示,嗜热脂肪地芽孢杆菌中NAD激酶编码基因大小为816bp,酶分子量大约为35kD。酶学性质分析表明,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶最适反应温度和pH分别为35℃、pH7．5,在35qC中保温2h后仍能保持80％左右的活性。Mn2＋、Ca2＋对该酶有较强的激活作用,在最适反应条件下该酶的比活力为4．43U／mg。动力学性质分析结果显示NAD激酶对底物NAD催化的k和圪。,分别为1．46mmol／L和0．25tzmol／（L·min）。NAD激酶在大肠杆菌的异源表达为以NAD为底物生物合成NADP提供了更多生物资源。     

普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。     

Cloning, expression and characterization of L-cysteine desulfhydrase gene from Pseudomonas sp. TS1138

L-cysteine desulfhydrase (CD) plays an important role in L-cysteine decomposition. To identify the CD gene in Pseudomonas sp. TS1138 and investigate its effect on the L-cysteine biosynthetic pathway, the CD gene was cloned from Pseudomonas sp. TS1138 by polymerase chain reaction (PCR) method. The nucleotide sequence of CD gene was determined to be 1,215 bp, and its homology with other sequences encoding CD was analyzed. Then the CD gene was subcloned into pET-21a(+) vector and expressed in Escherichia coli (E. coli) by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducement. The recombinant CD was purified by Ni-NTA His-Bind resin, and its activity was identified by the CD activity staining. The enzymatic properties of the recombinant CD were characterized and its critical role involved in the L-cysteine biosynthetic pathway was also discussed. __________ Translated from Microbiology, 2006, 33(4): 21–26 [译自: 微生物学通报]     

地芽孢杆菌Y565-5分离鉴定及其木糖异构酶基因xylA的克隆表达和酶学性质

从甘肃玉门油田地表土中分离到一株嗜热木糖利用菌,地芽孢杆菌Y565-5。利用PCR方法从该菌株中克隆得到一个木糖异构酶基因,xylA。该基因开放阅读框长1182 bp,编码394个氨基酸,XylA氨基酸序列与Geobacillus sp.Y412MC52相似性达到99%。将xylA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,得到重组质粒pET-28a(+)-xylA,然后将此重组质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测出明显的45 kD(相对分子质量)特异性蛋白质条带,并且通过半胱氨酸咔唑法检测出表达产物具有木糖异构酶的活性。对其酶学性质的研究发现,XylA最适温度为90°C,最适pH值为8.0。