缺失PHO13基因与进化工程构建高效利用木糖酵母

过表达了木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组工业酿酒酵母菌株KAM-6X内缺失了编码对硝基苯磷酸盐磷酸化酶的PHO13基因,接着通过EMS诱变和进化工程筛选,获得了一株高效利用木糖的菌株,命名为PE。有氧条件下,在含50 g/L木糖和100 g/L木糖的YPX中最大比生长速率分别为0.299和0.282 h^-1,分别比出发菌提高了95.43%和102.87%,同时PE菌株能在前24 h内耗掉36.12 g/L木糖,48 h内耗掉70.25 g/L木糖。微好氧条件下副产物产量降低,糖醇转化率最高达到0.382 g/g,证明PE是一株高效利用木糖发酵的工业酵母菌株。     

木糖发酵酒精代谢工程的研究进展

木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环,但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种. 近年来,根据代谢工程原理,利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造,或将木糖代谢途径引入传统的酒精发酵菌酿酒酵母及高酒精产生菌运动发酵单胞菌中,从而拓展其底物利用范围;或使原本可以利用多种糖底物的细菌获得选择性产生酒精的能力,构建了各种不同类型的木糖发酵重组菌株. 虽然这些重组菌株在木糖转化酒精方面均显示出良好的应用前景,但仍存在诸多问题. 有必要在对木糖代谢调控机制深入系统研究的基础上,进一步改造现有菌株,并结合生化工程技术对重组菌株发酵条件进行优化,以实现高效生物转化木质纤维素原料制取乙醇. 本工作介绍了近年来代谢工程改造微生物菌种发酵木糖生产酒精的研究进展.     

过表达嘌呤合成途径关键酶基因对重组酿酒酵母菌株生产cAMP的影响

研究了环磷酸腺苷(cAMP)合成途径中的3个关键酶基因(磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1)过量表达对重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵向胞外分泌cAMP的影响,利用酿酒酵母游离型质粒YEplac195和磷酸甘油酸激酶PGK的强启动子PGK1p及终止子PGK1t构建含PRS1, PRS3, ADE4和ADK1的单基因表达载体,分别转入cAMP生产菌GA125,通过摇瓶发酵实验考察重组菌株与对照菌株的生长、cAMP生产及胞外腺嘌呤消耗情况. 结果表明,在外加腺嘌呤条件下,与对照菌株相比,PRS1, PRS3和ADE4基因过表达菌株的cAMP产量分别提高4.17%, 9.03%和6.06%,而ADK1过表达菌株的cAMP产量降低3.85%.     

异源转氢酶NNT对酿酒酵母木糖代谢的影响

表达有毕赤酵母木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的重组酿酒酵母,能代谢木糖.但是XR和XDH分别偏好辅酶NADPH和NAD⁺,造成辅酶的不平衡和副产物的积累,所以重组酿酒酵母利用木糖产生乙醇的效率很低.转氢酶可以催化辅酶NADPH和NADH之间的相互转化,因此本实验将黑曲霉的转氢酶基因NNT转入到重组酿酒酵母中,通过实验确定了NNT基因的表达蛋白在酵母细胞内定位于线粒体中,NNT基因分别用pPGK1、pCCW12和pHXT7启动子进行表达,在微好氧的木糖发酵条件下,NNT基因的导入使酿酒酵母甘油产量下降,乙醇产率提高,在由pCCW12和pHXT7表达NNT基因的重组酿酒酵母中,木糖醇产率分别下降86.3%和49.3%,乙醇产率提高16.7%和12.7%,说明转氢酶NNT的存在改善了木糖代谢的辅酶不平衡,提高了乙醇的转化率.     

木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。     

酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状

酿酒酵母具有安全性好,高产量和高的抑制剂耐受性等优点,故一直在生物乙醇工业中有重要作用。然而该酵母不能使木糖发酵,而木糖是木质纤维素水解产物中重要的戊糖。为了得到利用木糖高效产乙醇的工程茵,我们通过引入初始木糖的新陈代谢和木糖的运输体来改变细胞内的氧化还原平衡．木酮糖激酶的过表达和磷酸戊糖途径来提高乙醇产率。     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展

寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容,但是,重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响,分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状,并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母,但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入,限制了重组菌株的定向改造。此外,目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。因此,加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析,注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响,结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化,从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性,是未来菌株构建的重要研究方向。     

整合型酿酒酵母菌株强化发酵和特性比较

为了提高木糖异构酶基因在重组酿酒酵母体内的稳定性,并比较不同真菌来源的木糖异构酶在木糖或者葡萄糖-木糖培养基的发酵利用特性,分别构建来自Piromyces sp.E2和Orpinomyces sp.的木糖异构酶基因的整合表达载体,利用同源重组将其整合进入呼吸缺陷型菌株的18S rDNA非转录区,结果测得Orpinomyces的木糖异构酶酶活活力为0.72 U/mg,比Piromyces的木糖异构酶酶活高2.8倍。在木糖培养基中发酵获得乙醇的得率分别为0.40 g/g和0.48 g/g。且整合入Orpinomyces的木糖异构酶基因菌株能获得最高酶活和乙醇得率。     

重组大肠杆菌利用D-木糖合成D-1,2,4-丁三醇

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol, BT)是一种重要的有机合成中间体。通过克隆表达恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)2-酮酸脱羧酶(mdlC)和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)D-木糖脱氢酶(xdh),敲除木糖利用和D-1,2,4-丁三醇合成中间代谢物分解途径中关键基因木糖异构酶(xylA)和2-酮酸醛缩酶(yjhH和yagE),重构大肠杆菌代谢网络,得到了能够将D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇的重组菌株。考察了温度、装液量、pH控制等条件对重组菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影响,在适宜条件下发酵36 h后D-1,2,4-丁三醇产量达到3.96 g·L^-1。探讨了葡萄糖利用与丁三醇合成的关系,通过敲除编码酶IICB^Glc的ptsG基因改造重组菌株的磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶(phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system, PTS)系统,菌株可以在利用葡萄糖生长的同时进行木糖的转化,具有更高的合成能力。     

类泛素介导和热激响应协同提高酿酒酵母的热稳定性

通过调节类泛素和热激响应介导的酿酒酵母内部的活性蛋白质平衡,提高酵母细胞的热稳定性和乙醇发酵性能,从而达到工业生产中降低控温能耗的目的。将5个蛋白质平衡相关基因分别与调控基因FBA1p组合构建耐热元器件,并将其导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeINVSC1,通过梯度升温培养筛选得到能赋予酵母细胞较好耐热性的类泛素元器件FBA1p-atg8和热激蛋白元器件FBA1p-hsp104;其对应的工程菌S.c-ATG8和S.c-HSP104在40℃恒定培养下,OD₆₆₀值均比对照高50%以上(84h),细胞存活率分别是对照的1.64倍和3.01倍(72h),且都具有较好的细胞壁完整性及海藻糖合成量。将atg8与hsp104组合构建成双功能耐热元器件,其工程菌S.c-ATG8-HSP104在40℃恒定发酵的生长能力、细胞活力和乙醇生产能力都明显优于S.c-ATG8与S.c-HSP104。结果表明,通过类泛素介导与热激蛋白响应协同调节胞内活性蛋白质平衡可以有效地提高酿酒酵母的热稳定性。     

木糖发酵菌种研究进展

综述了已发现的发酵木糖的天然微生物种类、木糖代谢途径及其机理以及近年来构建基因工程菌发酵木糖生产乙醇的研究进展.重点介绍了酿酒酵母、运动发酵单胞菌以及大肠杆菌的基因改造情况.     

重组酵母发酵半纤维素水解液生产酒精的研究

玉米秸秆中的半纤维素主要由五碳糖组成,普通的酿酒酵母不能发酵五碳糖。今利用基因重组酵母Sacchromyces cerevisiae ZU-10发酵玉米秸秆半纤维素水解液生产酒精,针对半纤维素水解液中的主要发酵抑制物,研究了硫酸根离子、乙酸、糠醛对重组酵母生长的影响,发现S.cerevisiae ZU-10细胞对SO42·,乙酸和糠醛的耐受浓度分别为5g·L·1、0.25g·L·1和0.08g·L·1。对玉米秸秆半纤维素的水解工艺进行了比较研究,结果表明,玉米秸秆采用1%H2SO4(固液比1:10),在95℃水解12h,其中的半纤维素水解率达到93%,发酵抑制物相对较少。半纤维素水解液经石灰中和、真空浓缩及离子交换处理后,可用于酒精发酵。半纤维素水解液的糖浓度与浓缩倍数及发酵抑制物浓度成正相关,对于重组酵母S.cerevisiae ZU-10,半纤维素水解液的适宜糖浓度为80g·L·1。在此浓度下,接种量1.2g·L·1(细胞干重计)、30℃、厌氧发酵96h,酒精浓度为31.05g·L·1,水解液中的木糖利用率达到95.85%。该研究结果对于促进半纤维素资源的转化利用,加速秸秆酒精的产业化进程具有重要意义。     

Synthetic Saccharomyces cerevisiae‐Shewanella oneidensis consortium enables glucose‐fed high‐performance microbial fuel cell

Microbial fuel cells (MFCs) were green and sustainable bio‐electrochemical reactors for simultaneous wastewater treatment and electricity harvest from organic wastes. However, exoelectrogens, such as Shewanella and Geobacter being widely studied in MFCs, could only use a limited spectrum of carbon sources. To expand the carbon source range being used in MFCs, we herein rationally designed a glucose‐fed fungus‐bacteria microbial consortium including a fermenter (Saccharomyces cerevisiae) in which the ethanol pathway was knocked out and the lactic acid biosynthesis pathway from Bovin was introduced into S. cerevisiae, and an exoelectrogen (Shewanella oneidensis MR‐1). We optimized the co‐culturing conditions of the microbial consortium to achieve an optimal coordination between carbon source metabolism of the fermenter and extracellular electron transfer of the exoelectrogen, such that lactate, the metabolic product of glucose by the recombinant S. cerevisiae, was continuously supplied to S. oneidensis in a constant level until glucose exhaustion. This metabolic coordination between the fermenter and the exoelectrogen enabled bioelectricity production in a glucose‐fed MFC. Furthermore, a porin protein encoded by oprF gene from Pseudomonas aeruginosa was incorporated into the outer membrane of S. oneidensis to enhance membrane permeability and its hydrophobicity, which in turn facilitated its biofilm formation and power generation. The glucose‐fed MFC inoculated with the recombinant S. cerevisiae‐recombinant S. oneidensis generated a maximum power density of 123.4 mW/m², significantly higher than that of recombinant S. cerevisiae‐wild‐type S. oneidensis (71.5 mW/m²). Our design strategy of synthetic microbial consortia was highly scalable to empower the possibility of a wide range of carbon sources being used in MFCs, e.g., xylose, cellulosic biomass, and recalcitrant wastes. © 2016 American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 63: 1830–1838, 2017     

絮凝酿酒酵母的构建及其发酵特性

把S.cerevisiae W303-1A的絮凝基因FLO[STBX]1[ST]〖HT5”〗和G418抗性基因kanMX接入质粒pYX[STBX]212[ST]〖HT5”〗,构建重组质粒pYX-FLO-kan并转化S.cerevisiae ZWA46,得到了较强絮凝能力且传代稳定的重组菌ZWA46-F2。考察其絮凝能力及发酵特性,实验结果表明：该重组菌在生长稳定期前期启动絮凝,与葡萄糖的耗竭非耦联;在初始pH 2.5～6.0范围内絮凝值无明显改变;乙醇产量最高达到8.6% (体积),乙醇对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的89.8%。重组菌ZWA46-F2良好的絮凝性能有利于从发酵液中分离细胞和细胞回用,在燃料乙醇工业生产中有一定的应用价值。     

Investigating glucose and xylose metabolism in Saccharomyces cerevisiae and Scheffersomyces stipitis via 13C metabolic flux analysis

¹³C metabolic flux analysis (¹³C? MFA) has been extensively applied in studying the glucose metabolism of yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae and Scheffersomyces stipitis. Here, we tried to augment the previous fluxomic studies by applying ¹³C? MFA to rigorously investigate the metabolic flux distributions in S. stipitis and the recombinant S. cerevisiae strains when xylose was utilized as the sole carbon substrate. It was found that less carbon fluxes were diverted into the TCA cycle in S. stipitis than the recombinant S. cerevisiae strains. Compared to single sugar utilization, the co‐utilization of glucose and xylose by S. stipitis led to increased metabolic fluxes into the futile pathway and the TCA cycle, but did not improve sugar‐based ethanol yield. In addition, heterologous expression of xylose pathway in engineered S. cerevisiae strains may affect the glucose utilization. © 2013 American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 59: 3195–3202, 2013