P[1]型A群牛轮状病毒VP8重组蛋白的表达与免疫原性研究

【目的】 利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA) VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】 根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1] VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】 本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17 783和1∶64。【结论】 本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。     

猪轮状病毒GZAS2020株与NX株VP7蛋白的结构预测和抗原表位分析

为了解猪轮状病毒（PoRV）VP7蛋白的生物信息学信息,运用Expasy-ProParam、YinOYang-1.2、TMHMM-2.0、ABCpred和IEDB等软件,预测分析PoRV临床分离株GZAS2020和疫苗株NX VP7蛋白的基本理化性质、结构功能和B细胞抗原表位差异。结果显示：两种VP7蛋白均属于稳定蛋白、亲水性蛋白、跨膜蛋白和非分泌性蛋白;分离株与疫苗株的O糖基化位点数分别为55和62,N糖基化位点数均为1,磷酸化位点数分别为29和30;亚细胞定位均位于质膜,均以α-螺旋和无规则卷曲为主要结构,延伸和β-转角贯穿其中;GZAS2020株的B细胞抗原表位位于67~72 aa（PYANSTT）、97~100 aa（KWTE）、176~179 aa（QQTD）、276~283 aa（TTAPQTER）,NX株位于96~99 aa（TKWK）、176~182 aa（QQTDEAN）、274~279 aa（DPTTTP）、310~317 aa（MSKRSRSL）,两者在97~100、176~179、276~279 aa处存在相同的B细胞抗原表位,但GZAS2020株在无规则卷曲位置（67~72 aa）存在独特的B细胞抗原表位。以上结果说明,疫苗株NX与贵州省流行株GZAS2020在主要抗原蛋白上存在差异。     

破伤风毒素T细胞表位P2对猪轮状病毒△VP8*蛋白免疫原性的增强作用

仔猪轮状病毒腹泻严重危害养猪业,为了开发亚单位疫苗,本课题组前期构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的VP8*蛋白(△VP8*,64~223位氨基酸)原核表达载体pET28a-SB-1A△VP8*。为了进一步提高亚单位疫苗的免疫原性,将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白,构建重组载体pET28a-P2-SB-1A△VP8*。P2-SB-1A△VP8*和SB-1A△VP8*在大肠杆菌中表达并纯化。重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示:P2-SB-1A△VP8*和SB-1A△VP8*在大肠杆菌中得到了高水平、可溶性表达;重组蛋白P2-SB-1A△VP8*诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8*,说明P2可以增强SB-1A△VP8*的免疫原性,为日后开发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

猪博卡病毒VP1蛋白抗原表位分析及其克隆表达

为研究猪博卡病毒(PBo V)VP1蛋白在血清学诊断中的作用,用DNAStar软件预测了PBo V NP08株(Gen Bank登录号KR014255.1)VP1蛋白的主要抗原表位,确定1-334个氨基酸为优势抗原表位区,构建重组质粒p ET32a-VP1,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为56.7 ku的重组蛋白VP1,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白的Western blot结果表明,表达的VP1蛋白与临床阳性血清具有良好的反应性。用该蛋白包被ELISA板,检测10份临床感染PBo V的猪血清样品和3份未感染猪的血清,结果表明其具有很好的特异性,不与未感染猪的血清发生反应,为建立PBo V感染血清学诊断方法奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。     

虎源FPV主要抗原表位区基因的原核表达及免疫原性分析

为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

轮状病毒VP7-U基因在胡萝卜中表达的免疫原性分析

轮状病毒是一种危害人类健康的腹泻病毒,缺乏可控性药物。将优化部分密码子的轮状病毒VP7基因（VP7 U基因）整合到胡萝卜（Daucus carota）植株中,并利用PCR、Western blot、ELISA等方法检测转VP7 U基因胡萝卜的蛋白表达情况。然后利用不同浓度的阳性VP7 U胡萝卜蛋白灌服小鼠,以灌服正常胡萝卜植株蛋白的小鼠为阴性对照,以灌服阳性细菌蛋白的小鼠为阳性对照,灌服4次后利用ELISA方法检测小鼠体内的IgG含量。结果表明,转VP7 U基因的胡萝卜植株在蛋白水平上有目的抗原的表达并且其表达含量有一定的增加。灌服阳性胡萝卜蛋白的小鼠IgG含量高于灌服阴性胡萝卜蛋白的小鼠,但低于灌服阳性细菌蛋白的小鼠。然而统计分析表明,阳性小鼠同阴性小鼠体内的IgG含量差异不显著。转基因胡萝卜口服疫苗的发展还有很多困难,需进一步深入研究。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株CV777毒株S基因基础上,选取S抗原优势表位EP(499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa和1368～1374 aa)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因,优化后通过编码柔性连接肽(G...     

猪轮状病毒GD1株VP7基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD1株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP7基因全长1 062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与国内外已知的13个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,相似性分别为77.4%～100%和78.6%～99.7%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD1毒株与轮状病毒A2,JP3-6毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP7基因保守序列,设计特异性引物扩增猪轮状病毒L1株VP 7全基因序列并进行序列测定及分析。结果显示, L1株猪轮状病毒VP 7基因全长为1062 bp,包含一个982 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与G5型参考毒株核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为88．8％～93．7％和93．3％～94．2％,系统进化树分析结果亦显示L1株与G5型参考毒株处于同一个群,由此确定L1株为G5型。与我国近几年流行的G9型毒株NMTL进行抗原表位分析结果显示,两个毒株在 aa25～aa29、aa86～aa102、aa142～aa152、aa211～aa226、aa263～aa286等区域存在明显差异,可能对其免疫保护性存在一定的影响。     

Mapping B-cell linear epitopes of NS3 protein of bovine viral diarrhea virus

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a member of the genus Pestivirus within the family Flaviviridae. NS3 is one of the immunodominance regions of the BVDV viral proteins. To identify the potential B-cell linear antigenic epitopes within BVDV NS3 region, serial overlapping truncations covering the whole region were expressed and purified, and screened by multistep of Western-blot. We found (₁VCKKITEHERCHVNI₁₅), (₂₀AFFGVMPRGTTPRAPVR₃₆), (₄₆RRGLETGWAYTHQGGI₆₁), (₂₈₁EGDMATGITYASYGYFC₂₉₇), (₄₂₆YSGEDPANLRVVTSQSPYVVVATNAIESGV₄₅₅) and (₄₈₁FIVTGLKRMAVTVGEQA₄₉₇) can be recognized by the BVDV infected bovine serum. These proteins have been confirmed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA). The results of this study might open new perspectives on the structure and antibody–antigen reaction of the non-structural proteins and may aid in the clinical application as well.     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答

以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)～141-160(20AA)～21-40(20AA)～141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值.     

猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。     

Characterization of the interaction between VP8 of bovine rotavirus C486 and cellular components on MA-104 cells and erythrocytes.

Rotavirus VP8*, the N-terminal trypsin cleavage product of VP4, has been shown to bind to MA-104 cells and human O type erythrocytes. To examine whether bacterially expressed VP8* binds to cellular components of MA-104 cells, the VP8* (aa 1-247) was expressed in E. coli and radiolabelled with 35S-methionine. The radiolabelled rVP8* was immunoprecipitated with antiserum to bovine rotavirus C486 (BRV). The rVP8* was found to bind to MA-104 cells and its binding was competed by BRV. To study the interaction between VP8* and receptors of erythrocytes, hemagglutination (HA) and hemagglutination inhibition (HI) assays were carried out using solubilized rVP8*. rVP8* showed HA which could be inhibited by antiserum to BRV. This interaction was also inhibited by gangliosides, demonstrating a sialic acid dependent interaction. To study the contribution of the C-terminal region of VP8* to HA, a number of approaches were used. First, a peptide spanning aa 230-247 was synthesized and antisera was raised against the peptide to see whether it could inhibit HA of rVP8*. Second, a truncated form of VP8* (tVP8*: aa 1-229) was expressed to examine its hemagglutinating activity. Third, the dimerization of rVP8* and tVP8* was compared by Western-blotting following electrophoresis using native SDS-PAGE. The results indicated that antibody to aa 230-247 inhibits hemagglutination by preventing dimerization of VP8* which in turn allows the molecule to cause HA. To characterize the interaction between the HA domain and sialic acid receptors, erythrocytes were treated with sialidases of different specificities. Arthrobacter ureafaciens, Clostridium perfringens and alpha 2-8 linkage-specific neuraminidase destroyed the ability of sialic acid of erythrocytes to interact with rVP8*, indicating that bovine rotavirus C486 binding requires an alpha 2-8 linkage but acetylation of the sialic acid is not necessary.