葡萄糖/葡萄糖氧化酶诱导H9c2心肌细胞凋亡模型的建立

目的 研究不同浓度高糖（glucose,G）/葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GO）对H9c2细胞凋亡的影响,以确定建立H9c2细胞因糖自氧化所致凋亡模型的合适浓度.方法 在含33 mmol/L葡萄糖的高糖培养液中以不同浓度的GO干预H9c2细胞12h,MTT比色法检测H9c2细胞的存活率;光学显微镜下观察H9c2细胞形态学;AnnexinV/PI结合流式细胞仪检测凋亡率;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针检测细胞内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平.结果 （1）随G/GO浓度增加,H9c2细胞的存活率逐渐降低,其中1.6 mU/mL、2 mU/mL、2.4 mU/mL和2.8 mU/mL组存活率显著低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）的存活率为49.3％±6.7％.（2）随G/GO浓度增加,H9c2细胞的细胞凋亡率逐渐升高,细胞呈现典型的凋亡特征,其中1.6 m U/mL、2 mU/mL、2.4 mU/mL和2.8 mU/mL凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）的细胞凋亡率为44.56％±3.02％.（3）G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）作用H9c2细胞12h时,ROS含量显著高于对照组,差异有统计学意义（荧光强度：47.70％±2.09％ vs.17.59％±0.75％,P＜0.05）.结论 G/GO引起的H9c2细胞氧化应激所致的凋亡有剂量依赖性,G（33 mmol/L）/GO（2 mU/mL）是建立H9c2心肌细胞凋亡模型的合适浓度.     

橙皮素对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的抑制效应研究

目的 探讨橙皮素(HES)对H₂O₂诱导的H9c2心肌细胞凋亡有何影响。方法 采用H₂O₂建立H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型,实验分为四组：正常对照组(Control组),H₂O₂损伤组(H₂O₂组),单纯橙皮素处理组(HES组),橙皮素预处理 H₂O₂组(HES H₂O₂组)。H₂O₂(400 μM)处理2 h建立心肌细胞氧化应激损伤模型,HES H₂O₂组于建模前1 h加入40 μM橙皮素。采用CCK-8法确定H9c2细胞活性;DCFH-DA 探针检测细胞活性氧簇(ROS)水平,流式细胞术检测心肌细胞凋亡,分光光度计检测Caspase-3活性。结果 橙皮素预处理可明显改善H₂O₂诱导的H9c2心肌细胞活性降低,并且呈浓度依赖性;给予40 μM橙皮素预处理后ROS的产生明显减少,Caspase-3活性显著下降,心肌细胞凋亡率下降到30%左右。结论 橙皮素对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡具有抑制效应。     

柚皮素对高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡及Nrf2/ARE信号通路的影响

[目的]探讨柚皮素(NAR)对高糖(HG)诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)凋亡及核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路的影响。[方法]将培养的H9c2细胞分为对照组(正常糖量)、HG组(35.5 mmol/L葡萄糖)、HG+NAR低、中、高浓度组(35.5 mmol/L葡萄糖+6.25、12.5、25.0μmol/L NAR)。用噻唑蓝法检测H9c2细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot法检测Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平。[结果]经HG处理的H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。经HG与NAR共同处理H9c2细胞后,NAR低、中、高浓度组H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P...     

miR-19b对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的 研究microRNA(miR)-19b是否在H2O2诱导的心肌细胞的氧化应激损伤中具有保护作用.方法 将大鼠H9c2心肌细胞株分为6组,空白对照组(L1),H2O2组(L2),H2O2+miR-19b mimic阴性对照(NC)组(L3),H2O2+miR-19b mimic组(L4),H2O2+miR-19b ...     

Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响

目的探讨纤维蛋白原样蛋白(Fgl)2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响及机制。方法空白试剂、阴性病毒和Fgl2 siRNA慢病毒感染H9C2心肌细胞,分别为空白对照组、阴性对照组、Fgl2-siRNA组,48 h后收集细胞,Western印迹检测各组细胞中Fgl2的蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹检测酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果空白对照组和阴性对照组Fgl2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),Fgl2-siRNA组Fgl2蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.01);与空白对照组及阴性对照组比较,Fgl2-siRNA组H9C2细胞凋亡明显降低,酶切caspase3蛋白表达显著下调,Notch1、Hes1蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论沉默Fgl2基因的表达可有效抑制H9C2心肌细胞凋亡,其机制与下调酶切caspase3蛋白表达、激活Notch1信号通路有关。     

H9c2心肌细胞葡萄糖转运蛋白4转位机制的研究

胰岛素抵抗是高血压 ,冠心病及心力衰竭等疾病的发病基础。目前认为其发生机制是由于细胞内负责葡萄糖转运的信号传导机制和 (或 )葡萄糖转运蛋白 (Ｇｌｕｔ)细胞内转位机制异常所致。本实验将研究Ｈ9ｃ2心肌细胞在胰岛素和Ｋ (使细胞膜去极化以模拟细胞收缩 )作用下Ｇｌｕｔ4的转位机制。一、材料和方法1.细胞培养和分化 :将Ｈ9ｃ2细胞培养在 10 %小牛血清的ＤＭＥＭ中 ,种植后 48ｈ ,换成 2 %血清的ＤＭＥＭ。 3～ 4ｄ更换培养液。 2周后 95 %的细胞融合并分化为肌细胞以用于实验。2 .细胞内膜 (ＩＭ)及细胞膜 (ＰＭ)分离 :将收集并离心沉…     

PPARγ低表达对Ang Ⅱ诱导H9c2心肌细胞肥大的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ低表达对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大(MCR)的作用及可能机制。方法 采用H9c2心肌细胞,拟高糖培养基与药物AngⅡ构建MCR模型。采用AD-PPARγRNAi重组腺病毒载体,感染到H9c2心肌细胞中,将实验分为对照组、Vehicle组、AD-PPARγRNAi组、MCR组、MCR+Vehicle组、MCR+AD-PPARγRNAi组。形态学上采用苏木素-伊红(HE)染色法观察MCR时形态大小的变化。通过Western印迹法检测PPARγ、肌球蛋白重链(MYH)7B、心钠肽(ANP)蛋白表达情况。结果 HE染色结果显示,MCR组与对照组比较、MCR+Vehicle组与Vehicle组比较、MCR+AD-PPARγRNAi组与AD-PPARγRNAi组比较,H9c2细胞核形态大小均变大。Western印迹结果显示：与对照组比较,MCR组MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05)。AD-PPARγRNAi重组腺病毒感染H9c2心肌细胞后,AD-PPARγRNAi组与对照组和Vehicle组比较,PPARγ表达...     

下调CopineⅠ抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡

目的 研究Copine Ⅰ（CPNE1）对缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）诱导H9c2细胞凋亡的作用及可能的机制。 方法 以H9c2心肌细胞为研究对象,建立H/R模型,细胞被随机分为对照组（CON）、H/R组、阴性对照（NC）+H/R和CPNE1 siRNA+H/R组,阻断实验用NF-κB的阻断剂PDTC（10 μmol/L）预处理细胞30 min。RT-PCR和Western blot方法用于检测CPNE1表达水平。细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性采用ELISA方法检测。细胞经Annexin-V/PI染色后用流式细胞仪检测凋亡率,Western blot方法检测claved-caspase3（c-caspase3）、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。细胞中NF-κB活性采用ELISA方法检测。 结果 与CON组相比,H/R组CPNE1表达水平上调、LDH活性升高、凋亡率上升、c-caspase3和Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达水平下降。与NC+H/R组相比,CPNE1 siRNA+H/R组细胞的LDH活性下降、凋亡率降低、c-caspase3和Bax蛋白表达减少、Bcl-2表达增多。此外,沉默CPNE1细胞核中NF-κB活性增强且蛋白表达上升,PDTC可逆转CPNE1 siRNA对细胞凋亡的抑制作用。 结论 下调CPNE1的表达能够抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡,其可能机制是通过增强NF-κB活性发挥心肌保护作用。     

外源性硫氧还蛋白对高糖、高脂刺激引起的H9c2细胞损伤和凋亡的影响

目的 观察给予外源性硫氧还蛋白（Trx）后对高糖、高脂刺激引起的心肌细胞损伤和凋亡的影响,并分析其可能机制.方法 将处于对数生长期的H9c2心肌细胞随机分为三组：正常对照组（普通DMEM培养基葡萄糖5 mmol/L加入20 mmol/L甘露醇）、高糖高脂组（DMEM高糖25 mmol/L培养基加入高脂600 μmol/L软脂酸）和Trx干预组（在高糖高脂组的培养基中加入3 ＊9滋mol/L Trx）.培养48 h后,分别收集培养基上清与细胞,进行指标检测.结果 与正常对照组比较,高糖高脂组乳酸脱氢酶及caspase-3活性均显著升高（P＜0.01）.给予Trx干预后,与高糖高脂组比较,Trx干预组乳酸脱氢酶及caspase-3活性均显著下降（P＜0.01）.与正常组比较,高糖高脂组Trx的表达量未见明显改变（P＞0.05）,但是Trx活性显著下降（P＜0.01）.结论 高糖、高脂刺激可以引起H9c2心肌细胞损伤和凋亡,其机制与内源性Trx活性的降低有关.外源性补充Trx可明显提高Trx的活性,减轻心肌细胞的损伤和凋亡.     

PEP-1-CAT预处理对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的:探讨细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶(catalase,CAT)对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-l-CAT融合蛋白,将H9c2细胞随机分为正常对照组(CTL)、缺氧复氧组(H/R)、H/R加CAT组(H/R+CAT)、H/R加PEP-1-CAT组(H/R+PEP-1-CAT)。分别向H/R+PEP-1-CAT及H/R+CAT组加入2 mol/L的PEP-1-CAT及CAT500μl处理6 h,将各组细胞置于缺氧箱中缺氧21 h,再复氧6 h。采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)水平;通过流式细胞仪检测细胞的凋亡水平;通过Western blot检测凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果:与H/R组相比,H/R+PEP-1-CAT组的细胞的LDH、MDA、细胞的凋亡率及Bax的表达量均明显下降,Bcl-2的表达量升高(P<0.05)。结论:PEP-1-CAT预处理通过抗氧化和抗凋亡的作用发挥对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用。     

微小RNA-34a调控高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的初步研究

目的探讨微小RNA-34a(miR-34a)对高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为3组:正常组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度33mmol/L),抑制剂组(miR-34a抑制剂浓度50nmol/L+葡萄糖33mmol/L)。采用定量PCR检测miR-34a和凋亡相关基因Bcl-2基因表达的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果与正常组比较,高糖组心肌H9c2细胞凋亡率明显升高(P<0.05),H9c2细胞miR-34a表达显著上调(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达减少(P<0.05)。与高糖组比较,抑制剂组H9c2细胞凋亡明显下降(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 miR-34a能调控高糖所致的H9c2心肌细胞凋亡,可能是通过直接抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达而实现的。     

H9c2细胞株在心肌缺氧/复氧实验中的应用

目的本实验对H9e2细胞株进行缺氧／复氧,旨在引进一种操作、培养简便,可传代且功能与分离培养的原代细胞相似的大鼠心肌细胞株。方法培养的H9c2细胞随机均匀分为常氧对照组（NC组,6只）和缺氧／复氧组（H／R组,6只）。细胞置于含95％N2,5％CO2的三气培养箱内缺氧3h,置于含95％空气、5％CO2的CO2培养箱中进行复氧培养。台盼蓝染色记数细胞,MTT法检测细胞存活率,检测培养基上清中乳酸脱氢酶（LDH）含量反映细胞损伤程度,并与在分离培养的乳鼠原代心肌细胞上进行的研究做对比。结果与常氧组相比,H9c2细胞缺氧／复氧处理后,存活率明显降低[（68．65±7．55）％比（91．95±9．13）％,P〈0．01],LDH漏出量增加[（132．38±24．07）U／L比（34．69±9．86）U／L,P〈0．01]。原代乳鼠心肌细胞缺氧／复氧处理后,LDH漏出量增加[（428．62±56．65）U／L比（116．02±23．01）U／L,P〈0．01]。结论H9c2细胞株具有与原代培养乳鼠心肌细胞相似的功能特性,易于分离培养,并可传代,在缺氧／复氧等实验中具有广阔的应用前景。     

左西孟旦对缺氧复氧诱导的H9c2细胞凋亡、PTEN和PI3K/Akt信号通路的影响

[目的]研究左西孟旦对缺氧复氧(H/R)条件下H9c2细胞凋亡的影响及相关机制。[方法]体外培养H9c2细胞,将细胞分为空白对照组、H/R组、左西孟旦低剂量组、左西孟旦中剂量组、左西孟旦高剂量组。采用四甲基偶氮噻唑蓝法检测H9c2细胞增殖;流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒分别检测SOD活性及MDA含量;荧光探针法检测活性氧(ROS)水平;Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路蛋白表达。[结果]与空白对照组比较,H/R组H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA含量、ROS水平、PTEN蛋白表达均显著升高(P<0.05),PCNA、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著降低,Bax显著升高(P<0.05)。与H/R组比较,左西孟旦低剂量组、左西孟旦中剂量组、左西孟旦高剂量组H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA含量、RO...     

胰高血糖素样肽1对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的 研究胰高血糖素样肽1(GLP-1)对H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤的保护作用及机制.方法 培养H9c2心肌细胞,随机分为常规处理的对照组、H/R组及1、5、10mol/L GLP-1组以验证GLP-1的保护作用,随机分为 si-NC 组、si-NC+H/R 组、si-NC+H/R+10 μmol/L GL...     

Effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization in rats

OBJECTIVE:

To explore the effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization (CME) in rats.

METHODS:

Forty rats were randomly divided into four groups (n=10 each): a sham operation (control) group, CME plus saline (CME) group, CME plus metoprolol (metoprolol) group and caspase-9 inhibitor Z-LEHD-FMK (ZLF) group. CME was induced by injecting 3000 polyethylene microspheres (42 μm diameter) into the left ventricle during a 10 s occlusion of the ascending aorta. Echocardiography, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling and Western blotting were used to evaluate cardiac function, apoptosis and activation of caspase-9/caspase-3, respectively, 6 h after CME.

RESULTS:

The echocardiographic parameters of left ventricular function were significantly decreased in the CME group compared with the control group (P<0.05); however, the metoprolol group and ZLF group showed significantly improved cardiac function compared with CME alone (P<0.05). Compared with the control group, the myocardial apoptosis rate and the levels of activated caspase-9 and -3 increased significantly in the CME group (P<0.05). Again, these effects were ameliorated by metoprolol and ZLF (P<0.05).

CONCLUSIONS:

The present study demonstrates that metoprolol and ZLF can protect the rat myocardium during CME by inhibiting apoptosis and improving cardiac function, likely by inhibiting apoptosis/ mitochondrial apoptotic pathway. These results suggest that antiapoptotic therapies may be useful in treating CME.