E2F-1基因过表达对胃癌细胞动力学影响机制

目的:了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响,并探讨E2F-1对胃癌细胞动力学影响的分子机制.方法:对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率; 流式细胞仪检测各组细胞周期分布.提取各组细胞的总RNA,逆转录成cDNA,用荧光探针与含有21 522条人类基因表达谱芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析.结果:与两个对照组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61%±5.19% vs 93.4%±10.29%,100%±0.00%,均P <0.05); 细胞周期阻滞在G0/G1期.在检测的21 522条基因中,与细胞增殖、生长和细胞周期相关的差异性表达基因有20条,上调基因9条,下调基因11条.结论:E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期,其分子机制可能与筛选出来的20条差异表达基因有直接的关系.     

曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶的生物信息学分析、基因克隆及蛋白表达

目的通过生物信息学分析预测曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶(SmFBPase)的生物学特性,同时对SmFBPase进行基因克隆及蛋白原核表达。方法通过NCBI网站对SmFBPase基因序列进行开放阅读框分析和核苷酸序列同源性分析。通过ExPASy网站预测SmFBPase的理化性质、结构及表位等特性。构建pET-28α-SmFBPase重组质粒,并转化入~E.coli~BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对其诱导表达,用Western blot进行鉴定。结果 SmFBPase由337个氨基酸组成,无信号肽、无跨膜区,理论相对分子质量约37×10~3,为稳定胞内蛋白。SmFBPase的氨基酸序列与人FBPase的氨基酸序列一致性为61.77%,且进化树中两者亲缘性较远,该蛋白含有13个B细胞表位。PCR、双酶切鉴定及测序分析,证明重组质粒构建成功。Western blot显示重组质粒转化BL21后成功诱导表达SmFBPase蛋白。结论生物信息学分析SmFBPase是一个具有潜在研究价值的药物靶点,原核表达的SmFBPase具有反应原性,为研究其糖代谢规律奠定了基础。     

1,6-二磷酸果糖对脑梗塞患者血清LPO、SOD水平的影响

１９９５～１９９８年，我们采用１，６二磷酸果糖（ＦＤＰ）治疗脑梗塞患者６７例并观察了患者治疗前后血清中脂质过氧化物（ＬＰＯ）、超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）水平的变化。现将结果报告如下。资料与方法：将１３３例脑梗塞患者（男７６例，女５７例，年龄３９～８２岁，平均５９８５岁；按１９９５年第四届全国脑血管病会议制定的各类脑血管病诊断标准，并经头颅ＣＴ或ＭＲＩ确诊）随机分为两组：治疗组６７例，将ＦＤＰ１０ｇ加入１００ｍｌ生理盐水中静脉滴注每日１次，连用１５天为一疗程，休息５天，行第二疗程治疗。对照组６６…     

1,6-二磷酸果糖对烧伤大鼠心功能和血液流变学的影响机制

为了对严重烧伤后心泵功能的降低进行有效的防治，本文选用Ｗｉｓｔａｒ大鼠２４只，观察１，６－二磷酸果糖（ＦＤＰ）对烧伤大鼠离体心脏功能和血液流变特性的影响。结果显示，应用ＦＤＰ后使血液流变学各参数:全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、纤维蛋白原、血清总胆固醇、甘油三酯、以及红细胞膜的刚度指数、红细胞聚集指数均明显降低，而氧释放系数显著升高，与烧伤组相比差别显著，与对照组相比无明显差别。同时心脏功能的各项指标均由烧伤后的降低而逐渐恢复:心输出量、左心室内压及其变化速率、冠脉流量、主动脉压力均显著升高，与烧伤组相比有明显差别，与对照组相比差别不显著。提示ＦＤＰ通过改善血液流变特性，有效地恢复全身的机能状态和微循环功能，并增强红细胞的运氧能力。ＦＤＰ还能促进ＡＴＰ的生成，增加心肌细胞的能量供应，从而提高心肌收缩力，增加心输出量，使受伤后的心肌维持较好的血液流变学特性。ＦＤＰ能改善烧伤后的血液特性是烧伤休克早期心功能得以恢复的重要原因之一，从而为临床烧伤病人的抗休克治疗提供理论依据。     

慢病毒介导的SUMO1P3基因表达对胃癌细胞侵袭、迁移、黏附能力及EMT的影响

目的探讨小泛素样修饰物基因(SUMO)1P3基因siRNA慢病毒对胃癌细胞侵袭、迁移、黏附能力及上皮细胞间质转化(EMT)的影响。方法将人胃癌BGC-823细胞分为空白组、NC组(转染阴性对照慢病毒载体)和si-SUMO1P3组(转染SUMO1P3基因的siRNA慢病毒载体)。Western印迹检测SUMO1P3下调效果及EMT相关E-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-SMA蛋白表达。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力及黏附能力;Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力。结果 si-SUMO1P3的组SUMO1P3蛋白表达明显低于空白组(P<0.05)。si-SUMO1P3组BGC-823细胞24～72 h细胞活力均明显低于空白组(P<0.05);si-SUMO1P3组在接种的30 min和60 min细胞黏附能力均明显低于空白组(P<0.05);si-SUMO1P3组细胞侵袭能力、迁移能力均显著低于空白组,E-cadherin蛋白表达显著高于空白组,Vimentin和α-SMA蛋白显著表达低于空白组(P<0.05)。结论抑制SUMO1P3基因表达可能通过阻碍EMT降低胃癌细胞侵袭、迁移和黏附能力。     

1,6-二磷酸果糖三钠盐提高小鼠缺氧耐受力的试验研究

目的 研究1,6-二磷酸果糖三钠盐对小鼠提高缺氧耐受力功能.方法 设低、中、高3个剂量组即83mg/(kg·bw·d)、167mg/(kg·bw·d)、500mg/(kg·bw·d),分别相当于人体推荐摄入量5倍、10倍、30倍,另设0mg/(kg·bw·d)对照组以无菌水代替受试物.受试样品用无菌水配制,低、中、高剂...     

1,6-二磷酸果糖三钠盐缓解小鼠体力疲劳功能的研究

目的 对1,6-二磷酸果糖三钠盐缓解体力疲劳功能进行了试验研究.方法 依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)进行1,6-二磷酸果糖三钠盐的缓解体力疲劳功能试验.结果 500mg/(kg·bw·d)组小鼠负重游泳时间长于溶剂对照组(P<0.05);500mg/(kg·bw·d)组小鼠血浆尿素水平低于溶剂对照组(...     

慢病毒介导miR-215过表达对克罗恩病的影响及作用机制

目的研究慢病毒介导miR-215过表达对克罗恩病(CD)小鼠的影响及其作用机制。方法 48只BALB/c小鼠随机分成空白组(A组)12只,模型组36只。模型组经2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模成功后的30只小鼠随机分成TNBS组(B组)、Lenti-Scramble(C组)、Lenti-miR-215(D组),每组各10只。每日观察小鼠体质量、粪便性状、隐血便血,计算小鼠疾病活动指数(DAI)积分;ELISA试剂盒检测血清白细胞介素-8(IL-8)、IL-10、髓过氧化物酶(MPO)的水平;HE染色观察结肠组织病理变化;Real-time PCR检测结肠组织miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA的水平;Western blotting检测结肠组织Beclin1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β蛋白的水平。结果与A组比较,B、C、D组小鼠DAI评分显著升高,miR-215 mRNA的表达水平显著降低(P0.05),B、C组IL-8、MPO、TNF-α和IL-1β表达水平显著升高,IL-10、Beclin1蛋白表达水平显著降低(P0.05)。D组小鼠DAI评分、IL-8、MPO、TNF-α和IL-1β蛋白水平均显著低于B、C组(P0.05),而IL-10、miR-215 mRNA、Beclin1 mRNA、Beclin1蛋白的表达水平显著高于B、C组(P0.05)。结论 miR-215过表达对于CD小鼠有一定的保护作用,该作用与Beclin1介导的自噬通道有关。     

慢病毒介导脯氨酰寡肽酶过表达抑制硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化

目的探讨慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶(POP)过表达对硫代乙酰胺(TAA)诱导的大鼠肝纤维化模型的影响。方法 40只雄性SD大鼠被随机分为4组,采用5%TAA诱导大鼠肝纤维化模型,各组分别在造模第1 w末门静脉注射生理盐水(正常对照组和TAA模型组)、空病毒(TAA模型+空病毒组)或携POP慢病毒(TAA模型+POP慢病毒组),在造模第4 w末处死动物,留取肝脏组织;采用苏木素-伊红(HE)染色及Masson染色观察肝脏病理形态学变化,采用化学比色法测定肝组织内羟脯氨酸含量,分别采用实时定量PCR或Western blot法检测POP m RNA表达或蛋白水平。结果模型组POP蛋白相对表达量较正常对照组水平显著降低(P0.05),而POP转基因组POP蛋白水平较其余三组均显著升高(P0.01);POP m RNA相对表达变化与POP蛋白相一致。TAA模型组和空病毒组的纤维化评分多为Ⅱ级,肝纤维化半定量积分分别为(15.2±1.69)和(15.3±4.62),显著高于正常对照组(1.75土0.63)和POP慢病毒过表达载体组(7.75±2.71)(P0.05);模型组和空病毒组肝组织羟脯氨酸含量分别为(504.47±111.15)μg/g肝质量和(498.32±90.87)μg/g肝质量,均显著高于正常对照组[(298.20±47.47)μg/g肝质量,P0.05],而POP转基因组大鼠肝组织中羟脯氨酸含量为(383.52±43.49)μg/g肝质量,显著低于模型组和空病毒组(P0.05)。结论肝纤维化时肝组织内POP水平下调,慢病毒载体可成功介导POP在大鼠肝组织内过表达,抑制TAA诱导的大鼠肝纤维化,降低肝组织羟脯氨酸水平。     

解偶联蛋白-2基因过表达慢病毒载体的构建

目的构建解偶联蛋白-2（UCP-2）基因慢病毒表达载体。方法用RT-PCR技术从转基因肥胖小鼠肝脏组织中获得UCP-2基因编码区片段,用In-Fusio技术将PCR产物连接入Age I单酶切后的慢病毒转移质粒体pGC-FU,进行鉴定及序列测定。将构建成功的转移质粒和两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、Helper2.0（VS-VG元件）共转染293T细胞,包装成慢病毒,浓缩纯化后检测滴度。结果RT-PCR产物经电泳证实成功获取UCP-2基因cDNA克隆,鉴定证实慢病毒转移质粒连接构建正确,病毒包装滴度为2×108TU/ml。结论成功构建了UCP-2基因慢病毒表达载体。     

1,6-二磷酸果糖联合抗病毒治疗对小儿病毒性心肌炎疗效的研究

目的:探讨1,6-二磷酸果糖(FDP)联合抗病毒治疗对小儿病毒性心肌炎(VMC)的疗效。方法:选择118例VMC患儿,随机分为常规治疗组和联合治疗组(在常规治疗基础上接受FDP治疗),各59例,均治疗2周。测量比较两组患儿治疗后的临床疗效及治疗前后肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)、心率(HR)、每搏输出量(SV)、心输出量(CO)、左室射血分数(LVEF)的差异。结果:联合治疗组治疗后总有效率显著高于常规治疗组(91.53%比71.19%,P=0.005)。与治疗前比较,两组治疗2周后CK、LDH、CK-MB、HBDH水平、HR均显著降低而SV、CO、LVEF均显著升高(P均0.01)。与常规治疗组比较,治疗2周后联合治疗组CK[(168.2±33.7)U/L比(126.4±30.4)U/L]、LDH[(199.0±41.3)U/L比(162.7±47.1)U/L]、CK-MB[(18.3±6.4)U/L比(12.2±6.6)U/L]、HR[(85.4±12.6)次/分比(80.2±12.3)次/分]降低更显著而SV[(82.4±13.4)ml比(89.5±14.0)ml]、LVEF[(50.1±8.5)%比(59.7±8.8)%]升高更显著(P0.05或0.01)。结论:FDP联合抗病毒治疗能显著改善VMC患儿心肌酶谱,恢复心脏泵血功能,临床疗效显著。     

1,6-二磷酸果糖对白细胞介素-1β致胰岛细胞损伤的保护作用

1型糖尿病是一种胰岛β细胞选择性破坏的自身免疫性疾病，而白细胞介素-1β(IL-1β)可能是其重要的内源性损伤因子。1，6-二磷酸果糖(FDP)对多种组织细胞有明显的保护功能。本研究旨在讨论FDP对IL-1β损伤胰岛细胞的保护作用以及保护机制与NO和Ca^2 的关系。     

1,6-二磷酸果糖对心脏病者左心室前1/3充盈率的影响

本文通过对60例心脏病患者使用1,6-二磷酸果糖(简称FDP)治疗前后左室舒张期充盈率(FR)和前1/3充盈率(1/3 FR)的比较,探讨其对心脏早期舒张功能的影响。资料与方法一、病例来源60例心脏病患者来源于1987年7月至1991年6月住院病人,女2例,男58例。年龄52～83岁,平均66.51岁。二、诊断标准本组中,53例冠心病(其中心肌梗塞14例),5例高血压心脏病,2例风湿性心脏病均按1979年WHO诊断标准明确诊断。     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的靶向杀伤作用

目的:研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD／ TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用．方法:构建的重组质粒pLenti6/V5-D-KDR- CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6.V5-D-GFP 在lipofectamine 2000介导下转染293FT细胞,包装扩增后获得病毒颗粒,体外感染表达 KDR的SW620细胞株和不表达KDR的LS174T 细胞株,荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞 CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药 5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应．结果:重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随慢病毒滴度的增高而递增．RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,SW620细胞有目的基因CDglyTK的表达．对于转基因的 SW620细胞,单用GCV(100 mg／L)时,其存活率为32.34％±2．42％．单用5-FC(2．0 g／L)时, 存活率为30．56％±2．14％．而联合应用两者时, SW620细胞存活率为5.36％±1．55％,LS174T 细胞存活率为95．48％±1．70％．SW620细胞对前药具有较高的敏感性,SW620与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P<0．001), 双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0．001)．当转基因细胞比率为40％时, 加入前药GCV和5-FC,SW620细胞存活率为11．42％±2．66％,而LS174T细胞存活率为 99．54％±2．61％,二者比较差异有显著性意义 (P<0．001),该体系旁观者效应明显．结论:慢病毒作为载体有较高的转染效率, KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞．     

慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨携带脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)基因的慢病毒转染大鼠肝星状细胞系-T6(hepatic stellate cellsT6,HSC-T6)对其生物学功能的影响,以揭示其在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。方法采用大鼠HSC-T6作为研究对象,设计合成携带大鼠POP基因的慢病毒,转染HSC-T6;通过ELISA方法检测各组HSC内Ac-SDKP水平;Real-time-PCR法检测各组HSC内相关基因表达量变化(POP、TGF-β1、α-SMA、MCP-1、Col I);Western blotting方法检测各组HSC中相关蛋白表达变化(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ);CCK-8和流式细胞术检测转染POP对HSC增殖和凋亡的影响。结果慢病毒能高效感染HSC-T6并表达有活性的POP蛋白,与正常对照组及空病毒组相比,POP慢病毒感染的细胞内Ac-SDKP明显升高,Smad7、PPAR-γ蛋白表达显著升高,而α-SMA表达显著下降;POP慢病毒感染的细胞内MCP-1及α-SMA mRNA表达显著下调;此外,POP可促进HSC-T6增殖生长,而对HSC-T6凋亡无影响。结论 POP在HSC内可能发挥抗炎、抗纤维化作用,其机制可能通过促进Smad7及PPAR-γ的表达,抑制MCP-1及α-SMA的表达而发挥作用。     

慢病毒介导大鼠肾脏基因转染的实验研究

目的 研究活体大鼠肾脏中慢病毒载体介导的基因转染及表达情况。方法 以水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)为包膜、携带以磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子启动的LacZ报告基因的慢病毒载体注射Lewis大鼠右侧肾脏实质，分别于注射后1、2、3、7天处死大鼠(每个时间点实验组n=3，对照组n=2)，通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)组织化学染色检测报告基因的表达。结果 实验组大鼠右肾可见β-Gal染色阳性细胞，而对侧肾脏及其他脏器均未见β-Gal表达；β-Gal的表达在。肾实质注射2天后达到峰值，到第7天仍能维持较高水平。β-Gal阳性细胞周围未见明显炎症细胞浸润。病毒载体注射的肾脏外观及组织形态学未见异常。结论 慢病毒载体能有效而稳定的将外源基因导入活体大鼠。肾脏而无明显毒副作用。     

慢病毒介导RNAi下调LMP2A基因表达抑制EB病毒相关胃癌细胞的体外生长

背景:EB病毒(EBV)与多种人类肿瘤,如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性肿瘤相关。病毒编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相关胃癌(EBVaGC)中,与肿瘤发生、发展密切相关。目的:应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制LMP2A基因表达,探讨下调LMP2A对EBVaGC细胞体外生长的影响。方法:构建慢病毒载体pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和阴性对照载体并转染EBVaGC细胞株GT38,以real-time PCR和蛋白质印迹法检测慢病毒载体的抑制效率,CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞术检测GT38细胞的细胞生长、细胞周期和细胞凋亡。结果:GT38细胞转染LMP2A-shRNA-LV后,LMP2AmRNA和蛋白表达分别下调65.4%和50.8%,进而导致细胞体外增殖受抑,克隆形成能力降低,G0/G1期细胞比例增加,细胞凋亡率增高,与转染阴性对照慢病毒载体和未予转染慢病毒的GT38细胞相比,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:慢病毒介导的RNAi技术能高效抑制LMP2A基因表达,进而抑制EBVaGC细胞的体外生长,诱导G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡。LMP2A可作为EBVaGC基因治疗的潜在靶点。     

慢病毒介导miR-203过表达对酒精性肝病大鼠肝损伤的保护作用及其机制研究*

目的 探讨miR-203对酒精性肝病(ALD)大鼠肝损伤的保护作用及其作用机制。方法 将60只SD大鼠随机分为ALD组(A组)、NC-miRNA/ALD组(B组)和miR-203/ALD组(C组)。将慢病毒质粒经尾静脉注射感染大鼠,并采用酒精饮料喂养法建立ALD模型,采用Realtime PCR法检测大鼠肝组织miR-203水平,常规行病理学检查,评估大鼠肝组织损伤情况。使用市售试剂盒检测大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)水平,采用Western Blot法检测肝组织IL-1β和NF-κB蛋白表达。结果 在建模8 w末,C组大鼠肝组织miR-203水平为(2.8±0.1),显著高于B组【(1.3±0.5),P＜0.05】;C组动物血清AST、ALT和TBIL水平分别为(89.5±7.9)U/L、(38.5±10.1)U/L和(27.8±5.1)μmol/L,显著低于B组【(162.8±16.5)U/L、(69.6±7.5)U/L和(54.9±7.8)μmol/L,P＜0.05】;C组肝组织匀浆SOD和CAT水平分别为(57.6±11.4)U/mg和(54.6±9.9)U/mg,显著高于B组【(41.6±7.6)U/mg和(45.7±6.0)U/mg,P＜0.05】,而MDA水平为(2.8±0.1)nmol/g,显著低于B组【(5.0±0.2)nmol/g,P＜0.05】;Western Blot检测结果表明,C组肝组织IL-1β蛋白和NF-κB表达分别为(0.7±0.2)和(0.3±0.1),显著低于B组【(1.2±0.3)和(1.0±0.2),P＜0.05】。结论 miR-203过表达对ALD大鼠肝损伤起到了保护作用,其可能的机制是增强了抗氧化和抗炎作用。