Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析

为调查禽腺病毒的感染状况,2008—2010年从广西南宁市活禽市场采集样品259份,通过SPF鸡胚传代增殖,经PCR鉴定,92份为禽腺病毒阳性,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株进行免疫琼脂扩散、血凝性、致细胞病变、形态学和鸡胚致病性试验。结果:8株均与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应,不能凝集鸡红细胞,病毒粒子具有腺病毒典型特征,可致鸡胚肝细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。将克隆的8株hexon基因进行序列比对及遗传进化分析,显示均与Ⅰ群禽腺病毒同源性最高,亲缘关系最近。结果表明,8株分离株均为Ⅰ群禽腺病毒。     

Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定

通过形态学、致细胞病变和序列比较等对一株疑为Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株FAVI-JS进行了鉴定,试验结果表明:该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称,直径为70 nm～80nm;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力但可以凝集大鼠红细胞.在鸡胚肾细胞(CEK)上可致细胞变圆,折光性增强等病变;通过PCR方法扩增出的FAVI-JS L、R、ITR三个片段,经过测序分析并与GenBank上发表的属于血清Ⅰ型的CELO病毒、FAV-1、FAV-A和血清8型的禽腺病毒(FAV-8)全基因组的相应序列比较,FAVI-JS与Ⅰ群禽腺病毒各毒株在三个片段上同源性都很高,其中与血清Ⅰ型的同源性高达96%以上,在根据对遗传上具有重要意义的ITR序列绘制的遗传进行树分析,FAVI-JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支,而与群禽腺病毒,特别是与血清Ⅰ型的禽腺病毒更接近,这些结果证明,FAVI-JS确为Ⅰ群禽腺病毒.     

I群禽腺病毒的分离鉴定及其致病性研究

为了解Ⅰ群腺病毒（FAV-I）在鸡群中的感染状况,对收集的178份疑似病料进行鸡胚病变、细胞病变特征分析,利用RT-PCR、基因测序和BLAST进行病毒的分离鉴定,成功分离出25株FAV-I,其中20株与血清4型同源性较高,5株与血清8型同源性较高。动物回归试验结果表明,攻毒鸡的临床症状和病理变化与自然发病鸡基本一致。     

禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法

禽腺病毒Ⅰ群(FAV-Ⅰ)是一种双链DNA病毒,病毒对外界环境耐受较强,并有水平传播及垂直传播两种传播方式,近年来在国内呈暴发式流行,各地养殖场均有报道检测到FAV-Ⅰ,FAV-Ⅰ对养殖业造成严重损失。分离、鉴定FAV-Ⅰ的毒株类型是防控此病的基础。除传统的检测方法外,近年新兴了多种检测技术,对这些分离、鉴定方法进行了概述。     

9株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及hexon基因的遗传变异分析

为了解山东省肉鸡场禽腺病毒的感染流行特点,为其科学防治提供依据,通过临床症状观察、病毒分离鉴定、鸡胚致病性试验、血凝试验、PCR检测及克隆测序等方法进行病原检测分析。结果表明,发病肉鸡主要表现为精神沉郁、采食减少等临床症状。鸡胚致病性试验可见死亡胚体呈全身出血、体型小、肝肿大现象。血凝试验显示,分离株不具凝集鸡、鸭、大鼠红细胞的特性。对hexon基因进行克隆测序分析显示,LY9株与Ⅰ群禽腺病毒血清8型亲缘性近,与参考株(58株)的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.6%。其余8株分离株间的核苷酸同源性为91.3%~99.8%,氨基酸同源性为97.8%~100%;与Ⅰ群禽腺病毒血清4型参考株(HB1510株)属同一进化分支,核苷酸同源性为93.1%~100%,氨基酸同源性为98.9%~100%。结论:从山东省4家肉鸡场分离到的9株病毒均为Ⅰ群禽腺病毒。     

Ⅰ群血清11型禽腺病毒的分离鉴定与遗传进化分析

为了确诊一起疑似禽腺病毒(FAdV)引起的感染鸡临床病例,本试验对山东临沂某养殖场送检的病鸡进行剖检、病毒分离鉴定以及对分离到的病毒序列进行比对与同源性分析.结果发现:病鸡出现心包积液,肝脏有大小不等点状出血斑,肝脏颜色变浅等症状.处理后的病料经SPF鸡胚卵黄囊接种后,病毒可使鸡胚发育迟缓,胚体出血,肝脏出现白色坏死斑...     

Ⅰ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及hexon基因的克隆与分析

从山东省自然发生疑似鸡包涵体肝炎的商品肉鸡群中分离到4株病毒。这些毒株的复制可被5-溴尿嘧啶2-脱氧核苷抑制,表明毒株的核酸类型为DNA;对乙醚和氯仿有抵抗力;耐酸不耐碱;对热敏感。根据已发表的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守区域设计合成了2对引物。用这2对引物对4株病毒的核酸模板进行PCR扩增,结果均扩增出与设计片段大小一致的片段。测序分析表明,4株分离株为Ⅰ群禽腺病毒。用本实验室自制的Ⅰ群禽腺病毒12个血清型参考毒株的抗血清进行双向琼脂扩散试验,证明4株病毒中1株为血清2型,其余3株为血清8型。     

I群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定

通过形态学、致细胞病变和序列比较等对一株疑为I群禽腺病毒江苏分离株FAVI_JS进行了鉴定 ,试验结果表明 :该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称 ,直径为 70nm～ 80nm ;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力但可以凝集大鼠红细胞。在鸡胚肾细胞 (CEK)上可致细胞变圆 ,折光性增强等病变 ;通过PCR方法扩增出的FAVI_JSL、R、ITR三个片段 ,经过测序分析并与GenBank上发表的属于血清I型的CELO病毒、FAV_1、FAV_A和血清 8型的禽腺病毒 (FAV_8)全基因组的相应序列比较 ,FAVI_JS与I群禽腺病毒各毒株在三个片段上同源性都很高 ,其中与血清I型的同源性高达 96 %以上 ,在根据对遗传上具有重要意义的ITR序列绘制的遗传进行树分析 ,FAVI_JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支 ,而与群禽腺病毒 ,特别是与血清I型的禽腺病毒更接近 ,这些结果证明 ,FAVI_JS确为I群禽腺病毒     

鸭源禽腺病毒分离株的致病性及细胞培养特性研究

为进一步了解Ⅰ群禽腺病毒鸭源分离株的致病性和生物学特性,采取接种鸡胚和鸭胚,攻毒SPF鸡和雏鸭,并应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL)培养观察细胞病变。试验结果表明,SPF鸡胚和鸭胚均出现死亡以及心包积液等典型症状,SPF鸡和雏鸭也引起不同程度死亡,且出现与临床送检病例类似的症状,PCR检测与序列分析证实分离的2株鸭源Ⅰ群禽腺病毒均为FadV-4血清型,病毒接种CEF细胞后没有细胞病变,而接种CEL细胞后则出现很强的聚集性、细胞变圆等典型病变。表明分离的鸭源FadV-4对SPF鸡和雏鸭均具有一定的致病性,对CEL细胞具有一定的适应性。     

血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究

从山东某疑似感染禽腺病毒的发病鸡群中采集病料并分离到一株禽腺病毒,克隆纯化后进行PCR检测和序列分析,鉴定该毒株为血清4型禽腺病毒,命名为GY株。用LMH细胞繁殖的GY株病毒滴度可以达到107.5 TCID₅₀/0.1mL,并建立了纯净稳定的种子批。动物致病性试验结果显示,攻毒鸡只8/10死亡,剖检均出现心包积液,肝脏肿大、出血或坏死,表明该毒株为强毒株。就攻毒途径、攻毒剂量等方面研究发现,GY株经胸部肌肉注射后发病率和发病时间相对颈部皮下注射途径更有优势,确定攻毒途径为肌肉注射;通过比较不同剂量(5×10^3.0~5×10^6.0 TCID50)GY株病毒攻击SPF鸡的致病性,将攻毒剂量定为5×10^5.0 TCID₅₀。研究表明,GY株可作为禽腺病毒4型攻毒用强毒株。     

Ⅰ群禽腺病毒血清10型的致病性

将Ⅰ群禽腺病毒血清10型山东分离株(SDXT株)通过皮下注射接种途径人工感染1日龄SPF雏鸡,观察试验鸡的发病情况及临床症状;于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组鸡只,采集心脏、肝脏、肺脏和肠道等组织固定、切片、H.E.染色,观察各器官病理组织学变化,并进行血常规和血液生化指标检测.同时,应用IFA对SDXT株人工感染雏鸡的各组织器官进行检测.结果表明,SDXT株接种后,引起雏鸡精神沉郁、食欲不振、嗜睡等症状.病理组织学变化以肝脏脂肪变性、肝脏结构紊乱、肝窦间出血和炎性细胞浸润,在肝细胞核内可见嗜碱性包涵体为主;肠道内肠绒毛脱落;肺脏广泛性出血和炎性细胞浸润为特征.IFA检测结果显示,肝脏、脾脏、肠道、肺脏均可检测到SDXT株,其中肝脏和肠道检出率最高,表明这2个器官是其主要靶器官.HGB、WBC、RBC、ALT和ALP发生显著变化.结果表明,Ⅰ群禽腺病毒血清10型对雏鸡有较强的致病性.     

Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验

【目的】了解江苏地区禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×10^5.33 EID₅₀剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%(1/10),病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发...     

禽腺病毒AH株的分离与鉴定

为获得禽腺病毒毒株,将临床疑似Ⅰ群禽腺病毒感染病例的肝组织,通过接种SPF鸡胚进行病毒分离,用PCR方法对分离产物进行扩增,将PCR产物进行序列测定,对测定的序列在NCBI网上进行分析,结果显示,从病料可分离出病毒,用PCR方法特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的片段,序列分析表明,分离株序列与禽腺病毒SD1-15分离株序列同源性99%,说明分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型。     

I群禽腺病毒的分离鉴定与同源性分析

为了解鸡群中I群禽腺病毒(FAd V-I)的流行现状,从山东、黑龙江、吉林等地部分大规模养鸡场采集病料,进行病毒分离、PCR鉴定及同源性分析。结果显示:从76份病料中分离到10株FAd V-I,分离率为13%;10株FAd V-I中,1株为血清4型,6株为血清8b型,1株为血清9型,2株为血清11型。结果表明,山东、黑龙江、吉林等地均存在一定的FAd V-I流行,主要流行血清型已由4型转变为8b型,因此需要评估当前的4型灭活苗能否有效防控这些地区的FAd V-I流行。     

犬腺病毒2型的分离鉴定和致病性分析

为了解湖北省犬腺病毒2型(CAV-2)的基因遗传变异特征,本试验从武汉市某比格犬养殖场采集免疫过犬四联活疫苗的临床发病犬的眼、鼻和肛拭子,将经PCR检测为CAV-2阳性的病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)进行病毒分离,对CAV-2分离株进行电子显微镜观察和间接免疫荧光鉴定,E3、Fiber、Penton和E1b基因PCR扩增和测序分析以及致病性试验。结果显示：经分离和鉴定共获得3株CAV-2,分别命名为HB404株、HB405株和HB078株。3株CAV-2分离株的E3、Fiber、Penton和E1b基因与国外疫苗毒株相似性分别为98.4%～99.6%、99.3%～99.9%、99.8%～99.9%和99.5%～99.7%;3株分离株的E3、Fiber和Penton基因与国内流行毒株相似性分别为96.6%～97.5%、98.5%～99.7%和99.4%～99.9%。且3株CAV-2分离株与国外疫苗毒株在同一分支,与国内流行毒株不在同一分支。HB405株能使犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻有分泌物、打喷嚏和咳嗽等临床症状。结果表明,3株分离株的亲缘关系与国外疫苗毒株较近,HB405株为强毒...     

Ⅰ群禽腺病毒及其疫苗研究进展

1987年以来,禽腺病毒(Fowl adenoviruses,FAdV)在世界范围内感染普遍。2015年,我国山东省首先爆发该病毒引起的疫病,之后各省市地区相继蔓延流行,给养禽业造成了很大的经济损失,特别以心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)和包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)造成的危害最大。本文主要将禽腺病毒的病原学、流行病学、临床特征研究及疫苗的研制等进展加以总结,以期为本病的防控提供参考。     

禽腺病毒血清4型QHD2021株的分离鉴定和全基因序列分析

为了解河北秦皇岛地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的遗传变异情况和致病性,本试验对疑似患FAdV-4病死鸡的肝脏、心脏等组织进行PCR检测,将PCR检测为阳性的组织接种鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离培养,对纯化后的FAdV-4进行全基因测序,对所得的序列进行同源性和遗传进化分析及致病性试验。结果表明：将PCR检测为FAdV-4阳性的肝脏、心脏匀浆于接种LMH细胞后72 h内出现明显细胞病变,初步确定分离毒株为FADV-4毒株,命名为FAdV-4 QHD2021株。全基因测序结果显示,QHD2021株全基因组全长44 225 bp,共编码14 741个氨基酸。与国外毒株相比短1 500 bp左右,但比国内毒株长约500 bp。同源性和遗传进化分析显示,QHD2021株与国内外FAdV-4流行毒株在同一支,与国内SD1601株的同源性最高,为94.3%。序列比对发现QHD2021株与国内流行株、国外经典株相比均出现1段1 966 bp的碱基缺失,包括ORF19、ORF27和ORF48的缺失。将经LMH细胞纯化的QHD2021株接种21日龄的SPF雏鸡后,可引起心包积液、肝炎等典型...     

Ⅰ群禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

在同源性分析基础上,确定了12个血清型penton蛋白同源性最高的2段基因并通过linker进行连接,以该串联基因原核表达蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备并筛选到2株可分泌FAdV-Ⅰ penton蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(Mab-penton-6#和Mab-penton-9#).2株单克隆抗体小鼠腹水经间接...     

血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID₅₀为10^-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。