RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

核糖核酸干扰抑制生存素表达诱导小鼠结肠癌细胞凋亡

目的筛选强效抑制生存素Survivin基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA),探讨Sur- vivin基因抑制对小鼠结肠癌细胞凋亡的影响。方法根据siRNA的设计规则和Survivin序列,设计3段侯选siRNA,聚合酶链反应(PCR)法制备表达框；将siRNA表达框与Survivin-绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达质粒(pSurvivin-EGFP)共转染293T细胞,24～48 h后根据荧光强度筛选强效siRNA；再制备其表达质粒转染小鼠结肠癌CT26细胞,应用实时荧光定量(FQ)-聚合酶链反应和蛋白印迹(Western blot)法分析Survivin基因的表达；DNA末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪(FCM)Annexin V/丙化碘锭(PI)双染色法检测细胞凋亡。结果筛选出1段高效抑制Survivin表达的siRNA,可使CT26细胞内Survivin mRNA拷贝数明显减少,抑制率为86．9%；蛋白表达水平亦显著降低；TUNEL检测显示转染48 h后RNA干扰组和对照组凋亡细胞数分别为(60．13±5．71)个和(5．47±0．63)个,两组差异有统计学意义(P＜0．01)；FCM检测转染后1、2、3、4 d凋亡细胞比率分别为2．1%、4．9%、11．7%和32．6%,对照组4个时间点凋亡率均低于1．5%,两组差异有统计学意义(P＜0．01)。结论siRNA能有效抑制小鼠结肠癌CT26细胞内Survivin基因表达并诱导结肠癌细胞凋亡。     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

小RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因表达对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响

目的观察Smo基因在胃癌MGC803细胞中的表达，及其对胃癌MGC803细胞增殖与凋亡的作用。方法半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测胃癌MGC803细胞中Smo基因的表达；化学合成3条针对Smo mRNA的小干扰RNA（siRNA），阳性脂质体介导转染胃癌MGC803细胞，半定量RT-PCR筛选出降解胃癌MGC803细胞Smo mRNA最有效的siRNA；噻唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测胃癌MGC803细胞Smo mRNA被降解后，对细胞增殖和凋亡率的影响。结果胃癌MGC803细胞内有Smo蛋白及Smo mRNA的强表达，siRNA-1、siRNA-2对胃癌MGC803细胞Smo基因表达均有降解作用，siRNA-1降解作用最明显，达61．7％，与隐性对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。siRNA-1转染胃癌MGC803细胞24h后，细胞增殖水平较隐性对照组明显下降（P〈0．05）；转染48h后，细胞凋亡率较隐性对照组明显上升（P〈0．05）。结论胃癌MGCS03细胞内存在Smo基因的高表达，降低Smo基因表达可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，Smo基因具有调控胃癌细胞增殖和凋亡的作用。     

神经酰胺对人膀胱癌细胞凋亡诱导作用及其机制

目的 探讨神经酰胺（cer）对人膀胱癌细胞的凋亡诱导作用及其机制。方法 不同浓度C2-神经酰胺（C2-cer）作用于膀胱癌T24细胞，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞存活率，吖啶橙（AO）荧光染色、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，并对半胱天冬酶（Caspase）-3活性、bcl-2蛋白含量和细胞色素C在细胞内的分布变化进行检测。结果 T24细胞存活率与C2-cer浓度呈负相关（r=-0．973，P＜0．01）。对照组和5、10、20、40μmol／L的C2-cer处理组凋亡率分别为2．95％、9．18％、14．23％、29．12％、48．46％，C2-cer处理组凋亡率显著高于对照组（P＜0．01）。Caspase-3活性随C2-cer浓度增加而增加，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。在C2-cer作用下，T24细胞内bcl-2蛋白含量下降，细胞色素C向细胞质释放。结论 降低bcl-2蛋白表达水平，从而促进线粒体细胞色素C释放和Caspase-3激活可能是C2-cer诱导膀胱癌细胞凋亡的重要机制。     

神经母细胞瘤Survivin基因表达和细胞凋亡的研究

目的：探讨神经母细胞瘤（NB）Survivin表达和细胞凋亡。方法：应用免疫组织化学技术和DNA原位末端标记技术检测26例NB中Survivin基因表达和细胞凋亡。结果：NB中15例有Survivin表达阳性细胞检出，阳性检出率57．7％。神经节母细胞瘤（GNB）的阳性检出率为20．0％，NB为66．7％；预后差组织（UFH）组为88．9％，预后好（FH）组这41．2％；I－Ⅱ及ⅣS期为27．3％，Ⅲ－Ⅳ期为80．0％。NB组、UFH组、Ⅲ-Ⅳ期标本Survivin阳性表达率高于GNB、FH、I－Ⅱ及ⅣS期标本，P值分别为0．0823、0．0243、0．0105。17例有凋亡细胞检出NB中12例有Survivin阳性表达，Survivin标记指数与凋亡指数（AI）呈负相关（n=12,γ=-0.591）、与生存时间呈负相关（n=12,γ=-0.629），AI与生存时间则呈正相关（n=16,γ=0.563）。结论：Survivin引起的凋亡抑制与NB发生发展关系密切，是患者预后的重要指标。     

靶向bcl-2基因StealthTM RNA干扰诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 应用RNA干扰技术,构建靶向bcl-2基因StealthTM RNA,转染入人肝癌细胞株,探讨RNA干扰诱导人肝癌细胞凋亡的机制.方法 确定并合成3对人肝癌bcl-2基因干扰序列;脂质体法转染入肝癌细胞株内;荧光显微镜下观察转染细胞并计算转染率;倒置显微镜下观察转染前后细胞形态学的改变;SP免疫细胞化学技术检测StealthTM RNA处理前后细胞bcl-2蛋白表达变化;流式细胞术检测StealthTM RNA干扰对癌细胞凋亡和周期的影响.结果 各组转染成功,荧光镜下显清晰的绿色荧光;各转染组转染率与时间有关,各组48 h的转染率最高(P＜0.01);转染组间StealthTM RNA Ⅰ组的转染效率最高(P＜0.01);倒置显微镜下观察见转染后见部分细胞边缘圆,折光度降低,细胞增殖减慢且易脱落;未转染组细胞呈上皮性贴壁生长,生长旺盛.免疫细胞化学显示,StealthTM RNA干扰后各转染组发现细胞的bcl-2表达减弱,与未转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞术结果示,各转染组细胞凋亡率明显升高,并出现凋亡峰,StealthTM RNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的凋亡率分别为(27.87±4.51)%、(24.50±0.89)%和(26.03±0.57)%,与未转染组细胞凋亡率(3.20±1.71)%,差异有统计学意义(P＜0.01).各转染组细胞发生显著的细胞周期阻滞,表现为S期细胞明显减少,G0/G1细胞明显增多.结论 靶向bcl-2基因StealthTM RNA成功的转染人肝癌细胞中,bel-2蛋白表达受抑制,并明显的诱导癌细胞发生凋亡.     

小分子干扰RNA抑制肺癌细胞Survivin表达对凋亡和顺铂耐药性的影响

目的 观察应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制肺癌A549细胞中Survivin表达对细胞凋亡和顺铂耐药性的影响.方法 设计、合成特异性抑制Survivin表达的siRNA,转染肺癌A549细胞48 h后,检测Survivin基因mRNA表达量以及肺癌细胞凋亡率和对顺铂耐药性变化.结果 A549细胞转染Survivin特异siRNA后,Survivin/β-actin基因mRNA表达比例1.17±0.25下降至0.41±0.18,抑制率65.10%;细胞凋亡率由2.67%上升至32.33%;顺铂半数抑制浓度(ICSO)由6.37 ms/L降低至2.42 ms/L.结论 通过siRNA特异性抑制肺癌A549细胞中Survivin基因表达可增加凋亡,逆转顺铂耐药.     

靶向环氧合酶-2的RNA干扰诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨靶向环氧合酶-2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对胃癌SGC-7901细胞增生和凋亡的影响。方法设计并合成6条COX-2小分子干扰RNA(siRNA)和1条阴性对照siR- NA,用TOPtranfection介导转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达,用流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况,并与对照组进行比较。结果TOPtranfection能够有效介导COX-2 siRNA和阴性对照siRNA转染胃癌SGC7901细胞；TOPtranfection介导的COX-2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX-2 mRNA表达,与对照组相比抑制效率90．0%以上,最高达98．3%,同时抑制胃癌SGC7901细胞COX-2蛋白表达,与阴性对照组及对照组相比,COX-2蛋白抑制率分别为72．0%和72．1%。试验组、阴性对照组及对照组胃癌细胞凋亡率分别为：22．28±3．62、1．23±0．27和1．03±0．14。试验组与阴性对照组(t= 14．214,P＜0．01)和对照组(t=14．378,P＜0．01)比较,差异均具有统计学意义,阴性对照组与对照组比较(t=1．635,P＞0．05)差异无统计学意义。结论靶向COX2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX-2基因和蛋白的表达,同时能明显增加胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞增生。     

Survivin基因对膀胱癌细胞体内生长的影响

目的探讨通过RNA干扰下调Survivin基因对膀胱癌细胞在体内生长的抑制作用。方法构建Survivin基因shRNA真核表达载体pRNAT-U6.1/neo-survivin,转染人膀胱癌细胞T24并获得稳定的单克隆细胞。观察裸鼠皮下移植瘤内注射靶向Survivin的siRNA及稳定转染pR- NAT-U6.1/neo—survivin对膀胱癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,肿瘤组织行免疫组织化学检测Survivin蛋白表达。结果经鉴定成功构建靶向Survivin的shRNA真核表达载体pRNAT-U6.1/neo-survivivn,稳定转染重组质粒的T24细胞Survivin mRNA表达下调达92.86%;瘤内注射50 mg siRNA-Survivin能够明显抑制肿瘤生长,与对照比较差异有统计学意义(P<0.01);未转染组在20 -29 d均发展为体积超过2000 mm3的肿瘤,转染组在43 d时形成3个体积不超过62.5 mm3肿瘤;免疫组织化学显示转染组肿瘤Survivin蛋白表达明显降低。结论裸鼠移植瘤内注射siRNA-sur- vivin明显抑制了肿瘤的生长;靶向Survivin的shRNA持久地抑制了膀胱癌T24细胞在体内的生长; Survivin基因可作为膀胱癌基因治疗的良好靶点。     

Stat3信号转导通路调控Survivin表达促进结肠癌细胞凋亡

目的 探讨Stat3/Survivn信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的作用机制.方法 用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸(20 mol/L)转染人结肠癌HT29细胞,噻唑蓝(MTY)法检测细胞增殖状态;流式细胞术检测细胞周期与凋亡;Western blot检测Stat3、p-Stat3、Survivin与bcl-2凋亡家族成员bcl-2、bcl-Xl于bax的表达.结果 Stat3反义寡核苷酸作用HT29细胞72 h后,G1期细胞比率由61.4%上升至75.6%,S期细胞比率由19.4%下降至8.6%,细胞增殖受抑制.凋亡细胞百分比由5.6%增加至22.1%,促进细胞凋亡.Stat3、p-Stag、Cychn D1与Survivin表达下降,bcl-2、bcl-Xl与bax变化不明显.结论 阻断Stat3通路可以抑制靶基因Survivin表达并诱导结肠癌细胞凋亡.     

siRNA磁性纳米颗粒协同外磁场对膀胱癌细胞存活素基因表达和凋亡的影响

目的观察葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在外磁场协同作用下转染存活素（survivin）小干扰RNA（siRNA）重组质粒对膀胱癌细胞survivin基因表达和凋亡的影响。方法利用化学共沉淀法制备DMN并作为基因载体,通过多聚赖氨酸静电吸附siRNA-survivin重组质粒,并在外磁场的协同作用下体外转染人膀胱癌BIU-87细胞,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术法、逆转录聚合酶链反应和Western Blotting检测BIU-87细胞的生长抑制率（IR）、凋亡指数（AI）、survivin mRNA及其蛋白的相对表达水平。结果构建的siRNA-DMN直径、有效粒径、比饱和磁化强度分别为10-12nm、94．8nm、0．19emu／g。DMN在外磁场的作用下转染siRNA-survivin入BIU-87细胞后的IR（39．60％）、AI（28．72％）均分别显著高于对照组和无磁场作用的DMN组（1．99％、3．75％和20．96％、16．71％）（P〈0．05）,survivin mRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于后两组。结论DMN在外磁场的协同作用下转染siRNA-survivin质粒入BIU-87细胞后可有效抑制survivin基因表达并诱导细胞凋亡。     

RNAi技术沉默Bcl-2基因对人膀胱癌细胞株T24增殖影响的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bcl-2蛋白表达的影响,MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用,Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70%;转染重组质粒后,T24细胞的活力降低为(66.9±5.6)%;重组质粒组的T24细胞凋亡率为34.55%～45.39%。结论pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒明显下调Bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡。     

胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体的构建及其抑制作用的研究

目的构建胰腺癌细胞生存蛋白（survivin）表达的RNA干扰（RNAi）抑制载体，并研究其对survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中survivin及其mRNA的表达，并把survivin基因克隆到T载体进行测序；构建针对survivin缺失碱基基因和survivin基因的RNAi载体si-svv-1和si—SVV-2，用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1后，用RT—PCR、DNA梯状电泳及流式细胞术分析比较2种干扰载体对survivin mRNA表达的抑制情况和检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达；si—svv-2对survivin mRNA的表达抑制率达（72．43&#177;8．04）％，而si—svv-1为0；si—svv-2能诱导胰腺癌细胞PANC-1的凋亡，72h细胞凋亡率达（12．36&#177;1．44）％。结论本研究成功建立胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体，该载体可特异有效地抑制胰腺癌细胞PANC-1survivin的表达并诱导胰腺癌细胞PANC-1凋亡。     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。