新生大鼠海马神经干细胞的离体培养及细胞连接的超微结构观察

目的观察体外培养的新生大鼠海马神经干细胞球的超微结构特点。方法取处于指数期的原代培养7d的新生大鼠海马神经干细胞,常规制备透射电镜样品后,用日立H-600透射电镜观察并摄片。结果光镜下神经干细胞呈克隆球散在悬浮于培养基中,Nestin免疫荧光阳性;电镜下观察到神经干细胞相互间排列比较松散、核浆比例高,细胞间胞膜增厚,形成特化的结构,有的胞膜上可见胞吞/胞吐小泡。结论体外培养的新生大鼠海马神经干细胞间的细胞连接有间隙连接样结构,并可出现胞吞/胞吐功能,提示细胞间可进行相互交流,传递化学递质或电兴奋活动。     

神经干细胞的分离培养及超微结构研究

目的研究神经干细胞分离培养及其超微结构特征。方法从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等神经组织分离神经干细胞，用无血清培养技术在体外进行培养、扩增和传代。采用免疫荧光技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，同时进行电镜结构观察。结果从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等组织获得了大量神经干细胞，可自我增殖并多向分化。神经球表面呈微绒毛结构，内层细胞结合较为松散．可见凋亡小体。部分细胞分化为具有突起和轴突样结构的细胞。结论分离培养的神经干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，并具有与功能相对应的超微形态结构。     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探寻出生后1～3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子，采用单细胞克隆技术，分离出生后1-3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养；以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞，以及其分化后的细胞进行鉴定。结果上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球，且具有连续克隆的能力；分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞．     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的 探寻出生后1~3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法 向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子,采用单细胞克隆技术,分离出生后1~3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养;以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞,以及其分化后的细胞进行鉴定。结果 上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球,且具有连续克隆的能力;分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论 新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞。     

海马神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的 :从海马分离鉴定出神经干细胞。方法 :机械分离新生鼠海马细胞 ,培养在无血清培养液中 ,选取单个克隆进行连续传代培养 ,用免疫组化检测nestin抗原和分化后神经细胞特异性抗原。结果 :从海马获得的细胞群能够连续传代 ,分离后的单个细胞能形成事迹球 ,免疫检测为nestin阳性 ;体外、体内分化的细胞分别显示神经元、星状胶质细胞、寡树突细胞抗原阳性。结论 :从海马分离出的细胞具有自我更新、增殖和分化能力 ,是神经干细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

胚胎大鼠海马神经干细胞分离培养和分化

目的：研究胎鼠脑海马组织去掉的神经干细胞的分离、培养、增殖及分化特点。方法：采用无血清培养、单细胞克隆技术及免疫细胞化学方法，观察海马源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：从大鼠胚胎脑海马分离的细胞具有增殖能力，可以传代培养，子代细胞免疫组化显示神经巢蛋白(nestin)阳性。经含血清培养基培养，贴壁可分化为微管相关蛋白-2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。结论：用本方法分离培养的细胞具有自我复制和多向分化的能力，是中枢神经系统的干细胞。     

海马神经干细胞的分化特征及鉴定

目的从新生SD大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞.方法分离新生SD大鼠海马组织,经机械吹打后,加入含有20 ng/mL的b-FGF以及B27的DMEM/F12无血清培养基悬浮培养具有自我更新和多向分化能力的细胞群,7 d后将一部分细胞固定并采用免疫细胞化学技术检测这些细胞中神经上皮干细胞巢蛋白(Nestin)的表达;另一部分细胞加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基使其贴壁分化生长7 d后固定并检测特异性成熟神经元抗原Tuj1以及星形胶质细胞抗原GFAP,少突胶质细胞抗原Galc的表达.结果从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达神经上皮干细胞特异性巢蛋白,它们分化成熟后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.结论从新生SD大鼠海马分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞群,它们有很强的分裂、增殖能力,是中枢神经系统的干细胞.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

培养胚胎神经干细胞向少突胶质细胞诱导分化的实验研究

目的培养大鼠胚胎神经干细胞,诱导分化获得较高纯度的少突胶质细胞。方法取孕11.5 d的胚胎大鼠神经管尾段制备单细胞悬液,无血清条件培养基培养,获得神经干细胞;加入胎牛血清诱导分化,利用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞不同的生长特性进行分离,获取较高纯度的少突胶质细胞。结果本实验得到纯度达90%以上的少突胶质细胞。结论利用培养大鼠胚胎神经干细胞诱导分化可以获取较多较高纯度的少突胶质细胞,以进行进一步研究。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

新生大鼠海马齿状回神经干细胞的鉴定及褪黑激素对其分化的影响

目的 :探索新生大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养及鉴定方法 ,并观察不同剂量褪黑激素对神经干细胞分化的影响。方法 :从新生大鼠海马齿状回分离得到神经干细胞 ,采用无血清培养技术进行培养 ,并采用 10、10 0 μmol/L褪黑激素诱导分化。应用细胞免疫化学方法进行神经干细胞巢蛋白 (nestin)、神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificenolase ,NSE)、胶质纤维酸蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)检测以进行细胞鉴定。结果 :鉴定表明从新生大鼠海马齿状回分离培养的细胞具有神经干细胞的特征 ,并可在体外增殖 ,经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。褪黑激素能促进神经干细胞向神经元分化 ,但低浓度组与高浓度组的褪黑激素对神经元的分化并无显著性差异。结论 :从新生大鼠海马齿状回成功分离培养了神经干细胞 ,是研究细胞诱导分化的良好模型。褪黑激素能促进神经干细胞向神经元分化。     

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化的形态学观察

目的:探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成大鼠长骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(BMSC),在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞.结果:增殖培养24～72h见细胞分裂像和克隆单位;继续增殖培养仍可见细胞克隆(干细胞特性);诱导培养第10日有成熟神经细胞形成.说明BMSC在体外培养条件下,经过多种因子的"程序性"作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化.结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,BMSC可成功诱导出神经元样细胞.     

谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用

目的:探讨谷氨酸对体外培养胎鼠神经干细胞的损伤作用,为开发神经干细胞保护药物的研究提供理论依据。 方法:取妊娠15 d的Wistar大鼠胚胎脑组织行体外细胞培养,采用免疫组化方法检测证实为神经干细胞。以正常培养的神经干细胞为对照组,谷氨酸处理组加入不同浓度的谷氨酸,MTT比色法观察神经干细胞的存活率。结果:从神经干细胞球内分化的细胞既有神经元又有神经胶质细胞,免疫组化结果显示,神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。谷氨酸处理组给药 24 h后,与对照组比较神经干细胞存活率明显降低,50 μmol·L^-1 谷氨酸组细胞存活率为86.45%,与对照组比较差异无显著性（P>0.05）; 100及1 000 μmol·L^-1 谷氨酸组干细胞存活率（分别为71.22%和15.14%）低于对照组（P<0.05,P<0.01）。结论:谷氨酸对神经干细胞有损伤作用,且呈剂量依赖关系,随着谷氨酸剂量的增加,神经干细胞的存活率逐渐降低 。     

Biological properties of neural progenitor cells isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys

Background The existence of neurogenesis in the hippocampus of adult nonhuman primates has been confirmed in recent years, however, the biological properties of adult neural stem cells or neural progenitor cells （NPCs） from this region remain to be extensively explored. The present work was to investigate on the expansion of NSCs/NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys and the examination of their characteristics in vitro. Methods NPCs isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys were expanded in vitro in serum-free media containing growth factors, and were then allowed to differentiate by removing mitotic factors. The expansion capacity of NPCs and their differentiation potential were assayed by immunohistochemical and immunocytochemical analysis. Results During primary culture, NPCs underwent cell division, proliferation and aggregation to form neurospheres that were growing in suspension. Without mitotic stimulation, most neurospheres adhered to the culture dish and started to differentiate. Eventually, nearly 12% of the differentiated cells expressed neuron specific marker-β Ⅲ-tubulin （Tuj1） and 84% expressed astrocyte specific marker-fibrillary acidic protein （GFAP）. In addition, the expression of a neural stem cell marker, nestin, was found both in NPCs and in the subgranular zone of adult monkey hippocampus, where NPCs were originally derived. Conclusions NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys can be expanded to some extent in vitro and are capable of differentiating into neurons and astrocytes. Further experiments to promote the in vitro proliferation capacity of NPCs will be required before adult NPCs can be used as a useful cell model for studying adult neurogenesis and cell replacement therapy using adult stem cells.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.