20S蛋白酶体β5亚单位对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响。方法:体外分离培养新生BALB/c小鼠(P0)的NSCs,应用免疫荧光染色观察PSMB5在NSCs中的表达与分布;利用real time RT-PCR方法检测PSMB5 mRNA的表达;荧光分光光度法测定PSMB5相关的糜蛋白酶活性的变化;应用PSMB5-siRNA抑制P0 NSCs中PSMB5基因的表达;使用含有PSMB5基因的重组慢病毒((lentiPSMB5))感染成年小鼠(P90) NSCs。利用CCK-8试验检测PSMB5对NSCs增殖能力的影响,利用BrdU和Tuj1染色观察PSMB5基因敲低和过表达对NSCs增殖及分化能力的影响。结果:PSMB5主要分布于NSCs的胞浆,P0的NSCs分化后,PSMB5 mRNA的表达下调。成年和老年小鼠NSCs中糜蛋白酶体活性较新生小鼠显著降低。PSMB5敲减后NSCs增殖能力和向神经元分化能力减弱,PSMB5过表达后NSCs增殖能力和向神经元分化能力增强。结论:PSMB5可能参与小鼠NSCs增殖及分化的调控。     

蛋白酶体功能障碍通过激活P53抑制人骨髓间充质干细胞增殖

 目的：明确蛋白酶体活性下降导致人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖能力降低的机制,探讨P53在此过程中的调控作用,以期为组织工程提供数量充足且活性优良的种子细胞。方法：检测早期（第3~4代）与晚期（≥14代） hBMSCs蛋白酶体活性及P53表达变化。将早期hBMSCs分为DMSO对照组、蛋白酶体抑制剂MG132组（10 μmol/L MG132作用4 h）和P53抑制剂pifithrin-α（PFT-α）+ MG132组（20 μmol/L PFT-α预干预1 h,随后加入10 μmol/L MG132作用4 h）,通过BrdU掺入实验和流式细胞术观察细胞增殖能力及细胞周期分布。随后将PFT-α直接作用于晚期hBMSCs,通过BrdU掺入实验检测P53抑制剂对晚期细胞增殖能力的影响。结果：体外培养晚期hBMSCs伴随蛋白酶体活性降低,P53表达水平较早期细胞上调16.89%±4.44%（P<0.05）。给予MG132能够显著抑制hBMSCs增殖,BrdU阳性率降低至33.36%±2.24%（P<0.01）;但是若提前给予PFT-α则能部分拮抗MG132对hBMSCs增殖能力的影响,BrdU阳性率上升至49.23%±2.67%（P<0.05）。流式细胞术结果显示,PFT-α+ MG132组各期细胞分布与DMSO对照组相似,增殖指数显著高于MG132组（P<0.01）。抑制P53激活能够显著提高晚期hBMSCs增殖能力,BrdU阳性率较对照组升高24.73%±8.35%（P<0.01）。结论：传代晚期hBMSCs蛋白酶体活性下降可能通过激活P53、影响细胞周期进程进而导致hBMSCs增殖潜能下调。     

靶向PSMB5基因的shRNA慢病毒载体对神经干细胞增殖和分化潜能的影响

目的:优化20S蛋白酶体β5亚单位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制。方法:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0)NSCs。倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性。比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响。Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响。结果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达。其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49%±4.81%(P0.001)和33.1%±2.54%(P0.001)。PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4%±1.48%(P0.01)。shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5±9.5(P0.01),神经球的平均直径为29.9μm±2.6μm显著低于对照组42.9μm±2.3μm(P0.01)。CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03(P0.001),PSMB5-shRNA组Tuj1+阳性率为39.13%±8.14%,较对照组显著降低(P0.01)。结论:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。     

恒磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨中心磁场强度为0.2 T的恒磁场对大鼠骨髓间充质干细胞的影响.方法:用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,对生长良好的第3代细胞进行中心磁场强度为0.2 T的恒磁场刺激,MTT法测定细胞增殖水平,流式细胞仪法测定细胞周期变化.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经磁场刺激5 d后,实验组细胞增殖水平和(S+G2/M)期细胞数量均有不同程度提高,差异有统计学意义(P<0.05).结论:恒磁场能促进体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的增殖水平.     

26S蛋白酶体参与人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元样细胞逐步分化过程中26S蛋白酶体的作用。方法:贴壁分离获得的hBMSCs先经β-巯基乙醇(β-ME)预诱导24h,随后用视黄酸(RA)诱导3d,最后再用生长因子(GF,10μg/LbFGF、20μg/LNGF)持续培养3d。免疫荧光染色观察不同诱导阶段神经前体细胞标志物nestin、早期神经元标志物Tuj1、成熟神经元标志物NF的表达。免疫荧光染色和RT-PCR分析不同诱导阶段26S蛋白酶体的表达变化。应用含26S蛋白酶体抑制剂的培养液(5μmol/LMG132、10μg/LbFGF、20μg/LNGF)作用于经β-ME/RA诱导后的细胞,NF免疫荧光染色观察蛋白酶体抑制剂对hBMSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:未诱导的hBMSCs几乎不表达nestin、Tuj1和NF;经β-ME/RA诱导后神经前体细胞标志物nestin和早期神经元标志物Tuj1表达率增高(34.41%±1.27%,27.79%±1.27%);经β-ME/RA/GF诱导后成熟神经元标志物NF表达率迅速升高(56.72%±2.40%)。免疫荧光染色和RT-PCR结果证实,未诱导hBMSCs26S蛋白酶体表达水平较低;经β-ME/RA诱导后个别细胞26S蛋白酶体染色增强,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.33倍;经β-ME/RA/GF诱导后26S蛋白酶体深染细胞增多,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.77倍。应用26S蛋白酶体抑制剂MG132后,NF阳性细胞表达率显著降低(37.59%±1.52%)。结论:hBMSCs在β-ME/RA/GF诱导下可逐步向神经元样细胞分化,26S蛋白酶体在诱导过程中表达水平逐步增高,26S蛋白酶体抑制剂能够抑制hBMSCs向成熟神经元分化,提示26S蛋白酶体可能参与诱导hBMSCs向神经元样细胞的成熟分化。     

低氧促进兔骨髓间充质干细胞增殖

目的 观察低氧/常氧间传代培养对兔骨髓间充质干细胞（rMSCs）增殖的影响。方法 将在5%O2下扩增的细胞接种后,或继续在5%O2下培养,记为L-L,或在20%O2下培养,记为L-N;对20%O2下扩增的细胞作同样的处理,分别记为N-N和N-L。取各组细胞进行生长曲线、集落形成率、葡萄糖乳酸代谢和胞内ROS的测定。结果 L-L组的细胞数和集落形成率最高,N-N组最低,而胞内ROS的水平则与此相反。低氧下培养的MSCs葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率较高,乳酸对葡萄糖的得率大于2.0mmol/mmol。结论 持续低氧传代培养促进rMSCs的增殖;低氧对MSCs增殖的影响与胞内ROS的表达密切相关。     

PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

背景：脊髓损伤后脊髓自身的修复和再生能力有限,细胞移植治疗脊髓损伤具有很强的临床应用价值和前景。 目的：探讨PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响,以期为组织工程提供更优良的种子细胞。 方法：采用脂质体法转染PTEN基因特异的siRNA沉默PTEN基因,RT-PCR 检测PTEN基因的表达,通过细胞生长曲线、细胞周期、Transwell实验观察PTEN基因修饰后细胞生物学特性的变化。 结果与结论：PTEN基因在骨髓间充质干细胞中高表达并且siRNA成功干扰了PTEN基因的表达,PTEN基因沉默后的细胞具有更强的存活、增殖、迁移能力,更适合作为组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。 目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7 d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。 结果与结论：慢病毒转染3 d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90%以上,实验组转染效率达85%以上。RT-PCR和Western blot检测结果显示, 环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSC）对大鼠脑胶质瘤C6细胞增殖的影响,并且探讨其相关机制。方法提取SD大鼠BMSC,进行体外培养、扩增。应用MTt比色法检测不同浓度BMSC上清液对C6细胞系增殖的抑制作用。用Transwell小室将BMSC与C6细胞进行双层培养,以HE染色法检测C6细胞形态变化。用划痕实验检测细胞迁移情况。结果MTF结果显示BMSC上清液对C6细胞有抑制作用,120h后1：8、1：4、1：2的BMSC上清稀释液、BMSC上清原液培养组的生长抑率分别为17．1％、26．0％、39．9％、43．1％;与BMSC进行双层培养后的C6细胞其形态发生了明显改变,由圆形或多角形变为长梭形,细胞包体伸出长突起;划痕实验显示在36h时对照组迁移率为100％,划痕完全愈合,而BMSC上清组划痕未见全愈合,迁移率为82％。结论①BMSC上清液能抑制胶质瘤C6细胞的恶性增殖,而且抑制效应呈剂量依赖性;②BMSC对C6的运动和迁移产生了抑制作用,从而降低了其恶性侵袭程度。     

骨髓基质细胞促进神经干细胞增殖分化

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）对神经干细胞（NSCs）增殖分化的影响。 方法:在体外比较NSCs在单独培养和在BMSCs条件培养液中培养下的分化和增殖情况。 结果:应用BMSCs条件培养液培养NSCs，分化的神经元比例较显著高于NSCs单独培养（41.1%±3.2% vs 23.3%±16.5%，P<0.05），而分化的星形胶质细胞所占比例显著降低（33.8%±4.9% vs 65.0%±10.4%，P<0.01），同时增殖细胞所占比例也显著增高（74.7％±4.7％ vs 51.4％±12.3％，P<0.01）。 结论:BMSCs对NSCs有促进其增殖和向神经元分化的作用。NSCs与BMSCs联合移植可能会增强NSCs移植的抗脑损伤作用。     

Differentiation of bone marrow stromal stem cells into cardiomyocyte-like cells in different mammalian species

We describe the possibility of obtaining cardiomyocyte-like cell cultures from rat, guinea pig, and human bone marrow stromal stem cells. The content of troponin I-positive cells attains 35-45% of the total number of cells in the cultures and persists at this level for up to 4 months under differentiation conditions. Spontaneous contractions of cardiomyocyte-like cells were observed after the formation of cell monolayer under differentiation conditions.     

Ultrastructural characteristics of human mesenchymal stromal (stem) cells derived from bone marrow and term placenta

Human mesenchymal stromal (stem) cells (hMSCs) isolated from adult bone marrow (BM-hMSCs) as well as amnion (AM-hMSCs) and chorion (CM-hMSCs) term placenta leaves were studied by transmission electron microscopy (TEM) to investigate their ultrastructural basic phenotype. At flow cytometry, the isolated cells showed a homogeneous expression of markers commonly used to identify hMSCs, i.e., CD105, CD44, CD90, CD166, HLA-ABC positivities, and CD45, AC133, and HLA-DR negativities. However, TEM revealed subtle yet significant differences. BM-hMSCs had mesenchymal features with dilated cisternae of rough endoplasmic reticulum (rER) and peripheral collections of multiloculated clear blisters; this latter finding mostly representing complex foldings of the plasma membrane could be revelatory of the in situ cell arrangement in the niche microenvironment. Unlike BM-hMSCs, CM-hMSCs were more primitive and metabolically quiescent, their major features being the presence of rER stacks and large peripheral collections of unbound glycogen. AM-hMSCs showed a hybrid epithelial-mesenchymal ultrastructural phenotype; epithelial characters included non-intestinal-type surface microvilli, intracytoplasmic lumina lined with microvilli, and intercellular junctions; mesenchymal features included rER profiles, lipid droplets, and well-developed foci of contractile filaments with dense bodies. These features are consistent with the view that AM-hMSCs have a pluripotent potential. In conclusion, this study documents that ultrastructural differences exist among phenotypically similar hMSCs derived from human bone marrow and term placenta leaves; such differences could be revelatory of the hMSCs in vitro differentiation potential and may provide useful clues to attempt their in situ identification.     

骨髓基质细胞促进人胚神经干细胞向神经元的分化

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)对人胚神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用机械法分离人胚NSCs,成球法进行传代培养,采用免疫荧光染色检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达鉴定NSCs。按培养方式不同,分为NSCs自然分化组、BMSCs和NSCs直接接触共培养组及Transwell共培养组,采用免疫细胞荧光法及免疫印迹法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。结果:在直接接触共培养组和transwell共培养组中,免疫荧光染色显示神经元标志物NSE阳性细胞率明显高于自然分化组,而星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞率低于自然分化组。免疫印迹检测显示Transwell共培养组中NSE表达量显著高于自然分化组,而GFAP表达量低于自然分化组。结论:BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。     

骨髓间质细胞中组织定向干细胞的鉴定

目的:验证骨髓中存在组织定向干细胞(TCSCs),为心血管组织工程提供理想的种子细胞来源。方法:采用SDF-1α梯度趋化从骨髓中分离CXCR4阳性细胞,免疫细胞化学法检测CXCR4与PDGFR-β表达,流式细胞仪检测PDGFR-β阳性细胞,从而确定平滑肌祖细胞(SMPCs)的比例;从骨髓分离培养内皮祖细胞(EPCs),免疫细胞化学和流式细胞仪检测FLK-1、CD34、CXCR4与vWF的表达情况。结果:SDF-1α趋化分离出的细胞几乎都为CXCR4阳性,其中4·67%的细胞呈PDGFR-β阳性;EPCs形态圆形或近三角形贴壁生长,原代细胞CXCR4、VEGFR-2、CD34明显阳性,传代细胞vWF阳性。结论:在骨髓基质细胞中存在SMPCs和EPCs等TCSCs。     

衰老模型骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖分化

目的研究衰老骨髓基质细胞对骨髓造血细胞增殖分化能力的影响,为阐述机体造血微环境衰老对造血干/祖细胞增殖的影响提供实验依据。方法全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓基质细胞,分为对照组和衰老组。衰老组:常规培养基内加入30 mg/m L D-半乳糖作用48 h。CCK-8法测定BMSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;Western blot检测P16、P21和P53蛋白表达。骨髓造血细胞与BMSCs共培养,集落计数检测髓系多向性造血祖细胞(CFU-Mix)增殖分化。ELISA检测BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF和SCF含量;DCFH-DA流式荧光检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比,D-半乳糖诱导BMSCs衰老,细胞阻滞于G0/G1期(P0.01),增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性率升高(P0.01);衰老相关蛋白P16、P21和P53表达明显上调(P0.01)。与衰老BMSCs共培养的骨髓造血细胞增殖分化能力减弱。衰老BMSCs内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降(P0.01);BMSCs培养上清液IL-1β、GM-CSF和SCF含量明显下降(P0.01)。结论衰老骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖、分化能力,其机制可能与骨髓基质细胞氧化损伤,分泌活性因子改变有关。     

骨髓基质细胞对中脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法:采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法,通过显微镜观察神经干细胞的分化状态;使用免疫组织化学技术,分析神经元在神经干细胞后代中所占的比例。结果:(1)骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元;(2)骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论:骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。