腺苷A1受体拮抗剂DPCPX对低氧复氧脑星形胶质细胞影响的实验研究

目的:观察腺苷A1受体拮抗剂1,3-二丙基-环戊黄嘌呤(8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine, DPCPX)对体外培养低氧复氧(hypoxia and reoxygenation, H/R)大鼠脑星形胶质细胞促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)释放量、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthase, GS)、超氧化物歧化酶(superoxide dimutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性的影响,探讨腺苷A1受体在H/R星形胶质细胞神经保护中的作用.方法:对大鼠大脑皮层星形胶质细胞进行体外培养并建立H/R模型,在低氧同时加入终浓度为100 nmol/L DPCPX 12 h后复氧1,6,12,24 h,检测EPO释放量,GS,SOD和GSH-PX活性的变化.结果:与对照组比较,DPCPX组H/R星形胶质细胞的EPO释放量显著减少;GS,SOD和GSH-PX的活性降低.结论:腺苷A1受体参与H/R星形胶质细胞的神经保护作用.     

灵芝提取物对神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制的离体研究

目的: 研究灵芝提取物(GLE)对原代大鼠皮层神经元氧糖剥夺-再复氧(OGD/R)损伤模型的影响,在细胞水平探讨GLE神经保护作用的机制。方法: 新生SD大鼠的皮层神经元原代培养至第7 d,用GLE预处理神经元OGD/R模型。选取OGD/R后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h作为观察点,观察GLE干预后对各个时点的细胞形态学、细胞毒作用、细胞线粒体活性、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达量的影响。结果: GLE(0.1、1、10 mg/L)能明显减少神经元LDH的释放,提高线粒体活性。流式细胞术结果证实了GLE能抑制神经元OGD/R损伤导致的凋亡,这种作用甚至能持续至OGD/R后的72 h。GLE(0.1、1、10 mg/L)下调caspase-3、caspase-8蛋白的表达,GLE (10 mg/L)还能下调caspase-9蛋白表达。结论: GLE对OGD/R诱导的神经元损伤有一定的保护作用,可能是有效防治急性缺血性卒中的神经保护药物。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC低氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（ZAL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。 方法:低氧(93%N₂-5%CO₂-2%O₂)环境中培养HUVECs 3 h后再恢复正常氧供应1 h。用MTT法检测细胞存活率, 分光光度法测定细胞培养上清液中LDH、SOD活性及MDA含量。 结果:HUVECs经低氧/复氧处理后,细胞存活率及SOD活性显著低于对照(P<0.01), LDH活性及MDA含量显著高于对照(P<0.01)；经不同浓度(10-9-10-6 mol/L)的ZAL或雌二醇（E₂）预处理后, 均可显著缓解上述改变，此作用为剂量依赖性，同浓度ZAL与E2的作用无显著差异。 结论:ZAL对低氧/复氧损伤的HUVECs可产生与E2类似的保护作用, 机制可能与促进自由基清除而减轻细胞氧化应激损伤有关。     

钙通道阻滞剂对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用

目的:观察钙通道阻滞剂对缺氧/复氧(A/R)心肌细胞的保护作用。方法:原代培养大鼠心肌细胞分为A/R、A/R+硝苯地平(Nif)、A/R+钌红(Ru)+肝素(Hep)和对照4组。检测各组心肌细胞内钙浓度(i)、细胞活力、ATP含量及孵育液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、[³H]-亮氨酸([3H]³H-Leu)掺入量、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)活性。结果:A/R+Nif和A/R+Ru+Hep组心肌细胞i、孵育液中LDH均显著低于A/R组(P<0.01);细胞活力、ATP含量、PKC和MAPK活性、³H-Leu掺入量显著高于A/R组(P<0.05或P<0.01)。结论:阻断心肌细胞外Ca²⁺内流及内贮Ca²⁺的释放,可通过减轻A/R介导的细胞Ca²⁺超载而对心肌细胞起保护作用。     

H2S通过cAMP介导PI3-K/Akt/P70S6K通路抑制缺氧/复氧后神经元的凋亡

目的: 研究H₂S对缺氧/复氧后神经元存活信号转导通路PI₃K/Akt/P70S6K的影响。方法: 取96孔和6孔培养板上培养7 d的海马神经元，正常培养组（C组）神经元按正常培养方法培养。NaHS组在进行缺氧/复氧时加入NaHS使其终浓度为150 μmol/L。Tri组、Rap组和Tri+Rap组在加入150 μmol/L NaHS的同时分别加入triciribin 10 μmol/L、rapamycin 10 nmol/L或triciribin 10 μmol/L+rapamycin 10 nmol/L。96孔培养板的神经元进行细胞存活力的检测。6孔培养板的神经元进行神经元纯度鉴定、神经元凋亡、cAMP和PI₃-K、Akt和P70S6K蛋白表达的检测。结果: NaHS显著增加了cAMP的浓度和PI₃、Akt、P70S6K蛋白的表达，同时增加了神经元存活率、降低了神经元凋亡率（P<0.01 vs C组和A/R组）。Triciribin抑制了Akt和P70S6K表达同时降低了神经元存活率、升高了神经元凋亡率（P<0.05,P<0.01 vs NaHS组）。Rapamycin抑制了P70S6K表达同时降低了神经元存活率、升高了神经元凋亡率（P<0.05,P<0.01 vs NaHS组）。结论： H₂S通过cAMP激活了PI₃K/Akt/P70S6K信号通路，抑制缺氧/复氧后海马神经元的凋亡。     

脂联素激活AKT抑制H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的: 观察脂联素(adiponectin)对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)凋亡的影响并探讨其作用机制。方法: 应用脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法观察脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡的影响;应用Western blotting法观察脂联素对Akt和caspase-3活性的影响。结果: 脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡具有显著的抑制作用(P<0.01)。脂联素直接激活Akt并增加了H₂O₂诱导的Akt活性,对H₂O₂诱导的caspase-3激活有显著抑制作用(P<0.01)。 Akt上游激酶PI3K的特异抑制剂LY294002 不但增加了H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡率,而且消除了脂联素的抗凋亡作用。结论: 脂联素对H₂O₂诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与其激活PI3K/Akt通路、抑制caspase凋亡信号通路有关。     

胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导SGC-7901细胞周期同步化研究

目的: 探讨胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法对人胃癌细胞SGC-7901细胞周期的影响。方法: 取对数生长期的SGC-7901细胞,加入2 mmol/L、4 mmol/L和8 mmol/L TdR孵育15 h,去除TdR孵育10 h,再次加入不同浓度的TdR孵育15 h后收集各组细胞,流式细胞术分析细胞周期各时相细胞百分比。经不同浓度TdR双阻断法诱导SGC-7901细胞后,再去除TdR孵育12 h,收集各组细胞分析细胞周期各时相细胞百分比。结果: SGC-7901细胞经2 mmol/L、4 mmol/L和8 mmol/L TdR双阻断法诱导,收获G₀/G₁期的细胞数分别为77.3%、77.5%和77.0%。再次去除TdR培养 12 h后,各期细胞百分比又可恢复正常范围。结论: 2 mmol/L TdR双阻断法诱导SGC-7901细胞即可在短时间内获得大量的G₀/G₁期细胞,是一种理想的获得大量处于"基态"的细胞的方法。     

损害性因素对乳鼠心肌细胞甘氨酸受体α1亚基表达的影响

目的：研究脂多糖（LPS）、缺氧/复氧（H/R）、异丙肾上腺素(ISO)以及高糖（HG）对乳鼠心肌细胞甘氨酸受体α₁亚基（GlyRα₁）表达的影响。方法：体外培养乳鼠心肌细胞，分别用LPS、H/R、ISO以及HG处理，采用CCK-8试剂检测细胞活力，RT-PCR方法检测心肌细胞上GlyRα₁亚基mRNA的表达。结果：LPS（5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80mg/L）、ISO（20 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L）以及HG（25 mmol/L、50 mmol/L）处理心肌细胞24 h与心肌细胞缺氧3 h/复氧3 h、单纯缺氧3 h对心肌细胞存活率无明显影响（P＞0.05）；LPS（5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L）、缺氧（3 h）/复氧（3 h）、单纯缺氧（3 h）以及ISO（20 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L）组心肌细胞上GlyRα1亚基mRNA表达均高于对照组（P<0.01），而HG（25 mmol/L、50 mmol/L）组心肌细胞上GlyRα₁亚基mRNA表达均低于对照组（P<0.01）。结论：一定浓度的LPS、ISO与一定时间的H/R、单纯缺氧均可上调乳鼠心肌细胞GlyRα₁亚基mRNA的表达，而HG可下调乳鼠心肌细胞GlyRα₁亚基mRNA的表达。     

线粒体氯通道蛋白在过氧化氢诱导C6细胞损伤中的作用

目的：利用过氧化氢(H₂O₂)复制神经胶质瘤C6细胞损伤模型，探讨线粒体氯通道蛋白/CLIC4的变化。方法:应用MTT法检测H₂O₂作用的C6细胞生存率；紫外分光光度法检测培养液上清LDH释放率；RT-PCR检测CLIC4的mRNA表达；Western blotting方法检测CLIC4的蛋白水平。结果:500 μmol/L H₂O₂作用C6细胞存活率与对照组相比未见明显差异；LDH释放率高于对照组；CLIC4蛋白水平明显强于对照组。而1000 μmol/L H2O2作用的C6细胞存活率明显低于对照组；LDH释放率明显高于对照组；CLIC4蛋白水平强于对照组。结论:CLIC4可能参与H₂O₂诱导神经胶质瘤细胞损伤的机制。     

［Ca2+］i对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜钙激活氯离子通道的调节作用

目的： 探讨细胞浆内游离钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）在常氧、急性和慢性低氧条件下对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜钙激活氯离子通道（Cl_Ca）的调节作用。 方法: 常规离体血管灌流法检测急性低氧时肺动脉环张力变化；钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养PASMCs，观察常氧和慢性低氧条件下［Ca²⁺］_i的变化并由此对Cl_Ca的影响；同时用四唑盐(MTT)比色法观察当［Ca²⁺］_i变化时Cl_Ca对PASMCs增殖的影响。 结果: (1) Cl_Ca阻断剂尼氟灭酸（NFA）和indaryloxyacetic acid (IAA-94)可以舒张急性低氧引起的肺动脉环收缩。(2) 慢性低氧时［Ca²⁺］_i升高：常氧状态下, PASMCs ［Ca²⁺］_i为(123.63±18.98)nmol/L，低氧时为(281.75±16.48)nmol/L (P<0.01)。(3) 常氧时，NFA和IAA-94对［Ca²⁺］_i 无明显影响(P>0.05)。(4) 慢性低氧时, NFA和IAA-94使PASMCs ［Ca²⁺］_i由(281.75±16.48)nmol/L降低到(117.66±15.36)nmol/L (P<0.01)。(5)MTT比色法中，慢性低氧状态下NFA和IAA-94引起升高的吸光度(A)值降低，由0.459±0.058到0.224±0.025 (P<0.01)。 结论: 低氧引起［Ca²⁺］_i升高，这可能激活Cl_Ca，对［Ca²⁺］_i起正反馈作用，Cl_Ca可能在低氧肺动脉高压中起作用；慢性低氧条件下Cl_Ca可能参与促进大鼠PASMCs的增殖。     

NO介导TNF-α诱导的培养大鼠缺氧/复氧心肌细胞的保护作用

目的:研究一氧化氮(NO)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。方法:在培养的大鼠乳鼠心肌细胞上,建立缺氧/复氧模型,测定复氧后培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和细胞内锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性。结果:(1)用TNF-α(10⁵U/L)预处理,缺氧/复氧后心肌细胞内Mn-SOD活性增高、LDH释放量减少;(2)NO供体硝普钠(SNP)(5μmol/L)和前体L-精氨酸(L-Arg)(5mmol/L)预处理心肌细胞3h,缺氧/复氧后细胞内Mn-SOD活性增高、LDH释放量减少,用Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)(100μmol/L)预处理减弱了TNF-α的抑制缺氧/复氧心肌细胞LDH释放和诱导Mn-SOD活性增高的作用;(3)可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ(10μmol/L)和CPK抑制剂chelerythrine(5μmol/L)可分别减弱SNP、L-Arg和TNF-α对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用;(4)TNF-α对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用可被抗氧化剂2-巯基丙酰氨基乙酸(2-MPG,400μmol/L)削弱,但是酪氨酸蛋白激酶(TK)抑制剂4,5,7-三羟基异黄酮(genistein,50μmol/L)预处理对TNF-α诱导的心肌缺氧/复氧保护无影响。结论:NO参与TNF-α对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用,PKC和SGC可能为其下游信号途径成分。     

肝细胞生长因子减轻皮质神经元的缺氧/复氧损伤

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对缺氧/复氧诱导大鼠皮质神经元凋亡的保护。方法分离培养SD大鼠皮质神经元,经HGF(15、30和60μg/L)预处理后经缺氧/复氧诱导凋亡,用MTT比色法检测细胞存活率;用Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测神经元的凋亡;用比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)和caspase-3活性变化。结果与正常对照组相比,缺氧/复氧组神经元的细胞存活率显著下降,细胞凋亡率和caspase-3活性升高(均P<0.05);而HGF预处理12 h可显著逆转缺氧/复氧所致的细胞存活率降低、凋亡率增加、LDH活性上升、caspase-3活性升高的改变(均P<0.05),且这些效应与HGF剂量正相关。此外,HGF的抗凋亡效应可被PI3K/Akt通路抑制剂LY294002阻断。结论HGF减轻缺氧/复氧所诱导的神经元凋亡可能与其激活神经元的PI3K/Akt信号通路、减少caspase-3表达有关。     

血管平滑肌细胞钙库Ca~(2+)动员的变化在休克血管低反应性形成中的作用

目的:探讨大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)在缺氧培养时胞内钙库钙释放的变化情况,并探讨胞内钙库钙释放在休克血管对去甲肾上腺素(NE)低反应性中的可能作用,为进一步阐明休克血管低反应性的发生机制提供依据。方法:建立大鼠失血性休克(40mmHg,2h)的在体模型及大鼠VSMCs缺氧细胞模型;采用Fura-3/AM钙离子成像方法测定VSMCs胞浆钙离子浓度([Ca2+])的变化情况及其与IP3受体(IP3R)及雷诺定受体(RyR)介导的钙释放通道的关系;采用离体器官张力测定技术,检测不同内钙释放依赖信号通路在休克血管低反应性形成中的可能作用。结果:在细胞外液无Ca2+的前提下,NE可通过动员内钙释放引起VSMCs胞浆[Ca2+]的明显升高;缺氧培养后VSMCs胞浆[Ca2+]较正常对照组有所升高,由NE诱导的VSMCs胞浆[Ca2+]较对照组有所降低,但均无显著差别;但在缺氧培养的VSMCs,细胞内钙库钙释放功能明显改变,表现为与正常对照组比较,缺氧VSMCs由IP3R敏感钙释放通道开放剂adenophostinA(10-5mol/L)及ATP-Na2(10-4mol/L)诱导的VSMCs胞浆[Ca2+]升高不显著,但RyR敏感钙释放通道开放剂caffeine可诱导缺氧VSMCs胞浆[Ca2+]的明显升高;失血性休克(40mmHg,2h)可引起大鼠腹主动脉血管对由NE诱导的收缩反应性明显降低,IP3R激动剂ATP-Na2(10-4mol/L)并不明显提高休克血管对NE的收缩反应性,但IP3R阻断剂heparin(104U/L)可明显抑制休克血管对NE的收缩反应性;此外,在无钙及含钙的K-H液中,RyR阻断剂ryanodine(10-5mol/L)可部分恢复休克血管对NE的收缩反应性,而RyR激动剂caffeine(10-3mol/L)可进一步降低休克血管对NE诱导的收缩反应性。结论:失血性休克后由RyR介导的内钙释放被激活部分参与了休克血管低反应性的形成。     

人参皂苷Rb1对大鼠胎鼠海马神经细胞凋亡的影响

目的：以原代培养的大鼠胎鼠海马神经细胞缺氧/缺糖再给氧为模型,观察人参皂苷Rb₁对神经细胞凋亡的抑制作用。方法：流式细胞术检测凋亡细胞百分率,荧光显微镜观察细胞形态学变化和坏死细胞百分率,同时,测定细胞LDH的释放和NO的产生量。结果：神经细胞缺氧/缺糖5 h后再给氧可诱导神经细胞凋亡和细胞坏死,并显著增加LDH的释放和NO的产生,并随再给氧时间的延长而增加。人参皂苷Rb₁能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率,减少LDH的释放和NO的过量产生,人参皂苷Rb₁的作用随剂量增加而作用增加。结论：人参皂苷Rb₁具有拮抗海马神经细胞凋亡的作用,这种作用可能与降低或抑制NOS活性,减少NO的过量产生有关。     

Hypoxic preconditioning of cardiomyocytes and cardioprotection: phophorylation of HIF-1α induced by p42/p44 mitogen-activated protein kinases is involved

Objective: To elucidate the molecular mechanisms involved in hypoxic preconditioning (HPC) of neonatal rat cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation (H/R) injury. Methods: Cardiomyocytes from neonatal Sprague–Dawley rats were randomly distributed into the following experimental groups: (1) HPC group: 20 min of hypoxia was performed to induce hypoxic preconditioning. Twenty four hours after HPC, cardiomyocytes were exposed to lethal hypoxia for 3 h followed by 3 h normoxia (reoxygenation). (2) Hypoxia/reoxygenation (H/R) group: cardiomyocytes were directly subjected to hypoxia (3 h) followed by reoxygenation (3 h). (3) PD98059+HPC (PD+HPC) group: cardiomyocytes were preincubated with PD98059 (a selective MEK-1/2 inhibitor, 50 μmol/l) 10 min prior to HPC. (4) BDM+HPC group: cardiomyocytes were pretreated with an activator of protein phosphatase 2,3-butanedione monoxide (BDM, 20 mmol/l) 10 min prior to HPC. (5) Control group: cardiomyocytes were incubated in cell incubator for 30 h. Viability of cardiomyocytes was assessed by MTT assay. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in medium was determined using a LDH assay kit. Activity of p42/44 mitogen-activated protein kinases (p42/44 MAPKs) was detected using Western blotting method. SDS-PAGE mobility shift experiments were performed to determine phosphorylation of Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α). Results: HPC promoted survival and membrane integrity of cardiomyocytes subjected to subsequent sustained H/R. The protective effects of HPC were completely abolished either by PD98059 [a selective inhibitor of MEK-1/2 (upstream activators of p42/44 MAPKs)], or by BDM (an activator of protein phosphatase). Western blot analysis showed activated p42/44 MAPKs in whole cell extracts from hypoxic preconditioned cardiomyocytes. SDS-PAGE mobility shift experiments showed increased phophorylation level of HIF-1α in HPC group, and the phosphorylation can be blocked by PD98059 or BDM. Conclusions: HPC protects neonatal cardiomyocytes against H/R injury by promoting cardiomyocyte survival and membrane integrity. The protective mechanism might be attributed to upregulation of HIF-1α phosphorylation which may be induced by P42/44 MAPKs.     

HIF-1α/SDF-1信号轴在低氧诱导祖细胞迁移和黏附中的作用

目的: 分析低氧对大鼠肺动脉内皮细胞低氧诱导因子(HIF-1α)及间质细胞衍生因子(SDF-1)表达的影响,探讨二者的相互关系(即是否存在HIF-1α/SDF-1信号轴)及其在低氧诱导祖细胞迁移和黏附中的作用。方法: 免疫磁珠分离纯化SD大鼠外周血CD34/CXCR4阳性祖细胞,免疫荧光、Western blotting及ELISA法检测不同低氧时间HIF-1α和SDF-1在大鼠肺动脉内皮细胞的表达,迁移和黏附实验检测常氧组、低氧组、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2)组、SDF-1中和抗体组及同时加2ME2和SDF-1中和抗体组祖细胞的迁移指数和黏附率。结果: HIF-1α和SDF-1的表达与低氧时间有关,低氧12 h时二者表达到峰值(均P<0.01),应用2ME2可使SDF-1表达下调(P<0.05),应用2ME2或SDF-1中和抗体后均下调祖细胞的迁移指数和黏附率(P<0.05)。结论: 低氧可诱导肺动脉内皮细胞HIF-1α及受其调控的下游因子SDF-1的表达,提示HIF-1α与SDF-1存在信号调节关系。HIF-1α/SDF-1信号轴在介导祖细胞迁移和黏附至肺动脉内皮细胞的过程中起重要作用。     

钙通道阻滞剂对缺氧右心室心肌钙调神经磷酸酶活性的调控作用

目的:探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在大鼠慢性缺氧性右心室肥大中的作用以及L-型钙通道阻滞剂对其的影响。方法:将大鼠置于氧浓度为(10±0.5)%的大型玻璃舱中每天24 h缺氧持续共7 d建立大鼠慢性缺氧模型。实验大鼠分为3组,每组各20只,即正常组、缺氧组、苯磺酸氨氯地平(norvasc)处理组,缺氧组持续缺氧21 d,norvasc处理组在缺氧的同时灌喂norvasc 30 mg·k^-1·d^-1。第21 d每组取10只大鼠分离心脏称重,并测CaN活性水平,另10只取心脏测定心肌细胞[Ca²⁺]_i。结果:(1)缺氧组右室与左室加室间隔的重量比、右室重/体重均明显高于正常组和norvasc处理组(均P＜0.01) 。(2)缺氧组右心室心肌细胞[Ca²⁺]_i 明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。(3)缺氧组右心室心肌CaN活性明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。结论: CaN可能参与了大鼠慢性缺氧性右心室肥大, L-型钙通道阻滞剂可能是通过降低心肌细胞内钙浓度,调控CaN活性而阻滞慢性缺氧右心室肥大。