芥菜型油菜WRKY71转录因子基因家族的鉴定及表达分析

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育及逆境胁迫中起重要作用。该研究在芥菜型油菜基因组概览测序的基础上,采用RT PCR技术克隆了4个芥菜型油菜WRKY71s基因,分别命名为BjuWRKY71 1 4。生物信息学分析表明,BjuWRKY71 1 4基因开放阅读框（ORF）分别为822、840、834和855 bp,分别编码273、279、277和284个氨基酸,预测分子量和等电点分别为30.80、27.11、31.58、32.18 kD和7.75、9.08、8.35、7.76。系统进化树分析表明,BjuWRKY71 1 4与白菜WRKY71转录因子相似性最高。亚细胞定位预测分析结果显示,BjuWRKY71s蛋白均定位于细胞核。这4个基因分别定位到芥菜型油菜的A09、B04、A07和scaffold144上。qRT PCR结果表明,4个BjuWRKY71s基因在高盐、脱落酸和低温胁迫下都有响应。在盐胁迫下, BjuWRKY71 3的表达量呈持续上升趋势,而其他3个基因在6 h时表达量达到最大,然后降低;在ABA处理下,BjuWRKY71s基因于6 h时表达量最大,随后逐步降低;低温处理后,BjuWRKY71s基因受低温诱导都显著上调表达。BjuWRKY71 4在该研究的3个胁迫条件下响应最为敏感。研究结果为进一步探讨该基因家族对芥菜型油菜逆境调控机制奠定了基础。     

白菜型油菜CBF基因克隆及功能分析

利用RACE技术从‘陇油6号’油菜中克隆得到1个新的CBF(C-repeat binding factor)基因(GenBank登录号为KP974691),全长1 000bp,其中包括5′-UTR 114bp,3′-UTR 241bp,开放阅读框645bp,编码215个氨基酸,推测的蛋白质分子量23.8kD,理论等电点为4.86。在氨基酸序列水平上,该基因与多种植物具有较高的一致性,其中与萝卜、紫茎泽兰、卷果涩荠和拟南芥的一致性分别为93.5%、83.7%、81.0%、79.0%。实时荧光定量PCR分析表明,CBF基因在油菜的茎、叶和下胚轴中均有表达,没有组织特异性;该基因表达受低温、ABA、H2O2诱导,MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA、H2O2诱导,与单独处理结果相比,CBF基因表达明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA、H2O2胁迫过程中发挥作用。     

香菜CsEF 1α基因克隆与表达分析

翻译延伸因子EF 1α(elongation factor 1 alpha)是细胞中最丰富的蛋白质之一,其在确保mRNA正确解码以产生细胞蛋白质方面发挥重要作用。该研究采用RT PCR扩增方法克隆香菜CsEF 1α基因序列,利用生物信息学对CsEF 1α基因结构、序列特征及系统进化等进行分析,并采用qPCR探究CsEF 1α基因在香菜不同生长时期和非生物胁迫下的表达模式,为进一步揭示EF 1α基因调控机制的研究奠定基础。结果显示：(1)成功克隆获得香菜CsEF 1α基因序列;CsEF 1α基因包含1个1 344 bp的开放阅读框,编码447个氨基酸,分子式为C₂₂₀₂H₃₅₄₄N₅₉₄O₆₄₄S₂₀,蛋白质分子量为49.29 kD,等电点为9.12;氨基酸序列组成中赖氨酸数量最多(49个,占11.0%),色氨酸数量最少(3个,占0.7%);属碱性蛋白。(2)CsEF 1α蛋白主要由无规则卷曲(36.91%)和α 螺旋(30.43%)构成,定位于细胞质;系统进化树分析显示,CsEF 1α与胡萝卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的亲缘关系较接近;启动子分析包括4种植物生长发育元件、3种激素响应元件和3种胁迫响应元件。(3)qRT PCR结果显示,CsEF 1α基因的表达量随着香菜生长发育时间的延长而升高,并且与转录丰度的变化一致;CsEF 1α基因对4种不同非生物胁迫的响应表达模式有所差异;随着胁迫时间的延长,在盐胁迫下CsEF 1α基因表现出先升高后降低趋势,而在低温、高温和干旱胁迫下表现出先降低再升高的趋势。研究表明,CsEF 1α基因参与了香菜对非生物胁迫的应答,在香菜生长发育和非生物胁迫中具有重要调控作用。     

盐及干旱胁迫对油菜抗氧化系统和RbohC、RbohF基因表达的影响

以白菜型油菜‘陇油6号’和‘天油2号’为试验材料,经MAPK抑制剂U0126、H₂O₂清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI和IMD预处理后再分别进行盐胁迫、PEG-6000模拟干旱胁迫,研究其对两种油菜幼苗活性氧、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因表达的影响.结果表明: 盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫下,两种白菜型油菜中H₂O₂积累量上升,O₂^-·积累量下降,抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX和谷胱甘肽还原酶GR)活性和RbohC、RbohF基因表达均升高.与单独胁迫处理相比,两种油菜O₂^-·积累、抗氧化酶活性和RbohC、RbohF基因的表达量均明显降低,经DMTU、DPI和IMD预处理后再分别进行盐和干旱胁迫,H₂O₂积累量下降,但U0126预处理后再进行胁迫处理,H₂O₂积累量上升.说明NADPH氧化酶、MAP激酶级联途径、H₂O₂参与了盐、干旱胁迫下活性氧产生、抗氧化酶活性变化和RbohC、RbohF基因表达的调控.     

辣椒CaNAC55基因克隆与表达分析

为揭示辣椒NAC转录因子的功能,以高抗疫病辣椒CM334为试验材料,克隆获得CaNAC55基因全长gDNA和cDNA序列。生物信息学分析表明,CaNAC55基因gDNA全长4 164 bp, cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 299 bp,基因编码的蛋白由432个氨基酸残基组成;基因序列比对和同源性分析结果表明,CaNAC55与辣椒(XM-016722474)、番茄(XM-004241285)和马铃薯(XM-006361027)的亲缘关系最近,氨基酸相似度分别达到99.87%、93.37%和92.62%。实时荧光定量分析表明,干旱、高盐、热激处理均可诱导CaNAC55基因表达,其中干旱、高盐、热激处理分别在24 h、24 h和12 h时表达量达到峰值,且分别为对照的3.01倍、20.92倍和8.84倍;ABA处理下,CaNAC55基因的相对表达量显著低于对照,说明CaNAC55基因的表达受到ABA的抑制。研究表明,辣椒CaNAC55转录因子对不同逆境胁迫的响应不同,推测辣椒CaNAC55基因可能作为重要的调节因子参与逆境胁迫响应。     

油菜FBA基因克隆、表达分析及其与抗旱性的关系

为了解果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)在油菜抗旱中的作用,揭示油菜干旱胁迫下FBA基因表达量、光合指标、产量等之间的关系,为油菜等作物抗旱性鉴定和抗旱性改良提供依据。以抗旱性强的甘蓝型油菜94005为材料,在初花期进行干旱胁迫处理,以正常浇水作为对照;测定叶片光合参数和FBA酶活性,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析FBA基因的表达量;采用RACE方法对FBA基因进行全长克隆,并对测序结果进行生物信息学分析;复水后生长至成熟期测定产量,分析产量、光合指标、FBA基因表达量等之间的关系。结果表明,随着干旱的加剧,油菜叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、产量均下降,FBA活性和FBA基因的表达量上升。在轻度、中度和重度干旱胁迫下,油菜叶片胞间CO_2浓度(Ci)显著下降,水分利用率(WUE)上升;极度胁迫下,Ci上升,WUE下降;油菜产量、净光合速率与FBA活性和FBA表达量呈显著负相关。FBA基因全长序列1440bp,ORF(开放阅读框)位于60—1172区域,编码370个氨基酸;蛋白分子量为38.51 KDa,等电点6.92;同源性对比显示,甘蓝型油菜FBA基因与拟南芥FBA基因的一致性在87%以上。二级结构预测结果表明FBA蛋白由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链以及β-转角组成,4种二级结构元件所占比例分别为43.85%、31.28%、17.60%、7.26%。因此,干旱胁迫下油菜的净光合速率下降、产量降低,随着胁迫的加剧,降低幅度增大。FBA基因与干旱胁迫密切相关,干旱胁迫下,FBA基因主要通过抑制光合、降低蒸腾、促进糖酵解和有氧呼吸等途径来提高植物对干旱胁迫的适应性。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

藜麦CqSAP8基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

该研究根据NCBI公布的藜麦胁迫相关蛋白(SAP)基因CqSAP8序列进行克隆,利用生物信息学分析CqSAP8蛋白序列、理化性质和结构特点,并采用qRT PCR方法检测CqSAP8基因表达的组织特异性及在非生物胁迫下的相对表达。结果表明：(1)藜麦CqSAP8基因CDS全长528 bp,编码175个氨基酸;预测CqSAP8蛋白分子量为18.73 kD,理论等电点为7.46,属于稳定的亲水性蛋白质;CqSAP8蛋白在N端和C端分别含有A20和AN1保守域,是SAP蛋白最典型的类型。(2)序列比对与进化分析显示,藜麦CqSAP8与甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8亲缘关系最近,序列相似性分别为89.66%和89.47%。(3)qRT PCR分析表明,藜麦CqSAP8基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达,且在种子中表达量最高;CqSAP8基因在干旱和高温胁迫12 h表达量达到最大值,分别是对照的13.09和17.47倍,高盐和低温胁迫下的最大表达量均为对照的3.91倍,说明藜麦CqSAP8基因响应多种非生物胁迫应答;另外,藜麦CqSAP8的表达量在ABA胁迫下24 h急剧升高,推测CqSAP8基因在非生物胁迫前期的响应不依赖ABA。该研究为进一步研究CqSAP8基因功能及抗逆分子机制奠定了基础。     

牡丹PsAGL6基因克隆与表达分析

该研究在转录组数据分析基础上,通过RT-PCR方法从牡丹(Paeonia suffruticosa.L)品种‘洛阳红’中克隆AGL6基因,并分析了其在不同组织和花型中的表达模式。结果显示:(1)AGL6开放阅读框长度732bp,编码244个氨基酸;结构域分析显示,该基因具有高度保守的MADS MEF2区、K区、AGL6I与AGL6II基序,归类于MADS-box基因家族,命名为PsAGL6,GenBank登录号为MF563611。(2)同源比对分析显示,牡丹PsAGL6与葡萄VvAGL6氨基酸序列相似度最高,达79%。(3)qRT-PCR分析结果显示,PsAGL6在牡丹各器官中均有表达,但营养器官中表达量较低,花器官中表达量较高,其中以萼片最高,花瓣与雌蕊次之;对4种牡丹花型花瓣的表达分析显示,PsAGL6基因在不同花型花瓣中的表达量差异明显,且蔷薇型牡丹花瓣相对表达量最高。研究表明,AGL6基因参与牡丹花器官的形成,为深入研究花器官发育的分子机制提供了帮助。     

甘蓝型油菜BnCYP79B1基因的克隆与表达

硫苷是十字花科植物的一种次生代谢产物,其合成途径受细胞色素P450的CYP79家族蛋白的调控,该实验采用同源克隆技术在甘蓝型油菜中克隆到了CYP79B1基因,命名为BnCYP79B1(GenBank登录号为JX535391.1)。BnCYP79B1基因cDNA全长1 625bp,编码一个含有541个氨基酸、理论等电点为8.88。序列对比结果显示,BnCYP79B1与花椰菜CYP79B1在DNA序列上的相似性为98.83%,推测蛋白氨基酸序列的相似性为99.26%。通过不同时期不同部位BnCYP79B1基因表达量的分析,发现BnCYP79B1基因在高秆高硫苷品系的根中表达量较高,而对矮秆高硫苷品系则是叶中表达量较高。在BnCYP79B1表达总量上,高秆品系较矮秆品系高,高硫苷品系较低硫苷品系高。     

甘蓝型油菜水苏糖合成酶基因克隆及表达分析

以甘蓝型油菜品种‘德油5号’为试材,采用RT-PCR和RACE方法首次从油菜中获得水苏糖合成酶基因cDNA全长序列,命名为BnSTS,GenBank登录号为HQ285880.1。该cDNA全长3 210bp,包含一个长为2 619bp的开放阅读框,编码873个氨基酸。通过构建原核表达载体,成功表达出预期蛋白。同源性比对结果显示,该基因编码蛋白与拟南芥STS相似性最高为82.08%。荧光定量PCR结果显示,基因表达水平与油菜种子发育过程中水苏糖含量变化具有相关性,与种子脱水耐性的获得具有时间一致性。该基因可能在种子脱水耐性形成机制中具有一定的作用。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

油葵HaGPAT1基因的克隆及表达分析

该研究利用RT-PCR技术,从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因(HaGPAT1),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测该基因在不同组织、种子不同发育时期以及不同胁迫条件下的表达特征。结果表明:HaGPAT1基因全长为1 656bp,编码551个氨基酸,相对分子量为62.132kD,等电点为8.84。系统进化树分析表明,HaGPAT1蛋白与高等植物莴苣的GPAT1亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,HaGPAT1基因在油葵花蕊中的表达水平最高,开花后17d的种子中次之;在干旱和盐胁迫条件下,HaGPAT1基因的表达水平均显著上调。研究推测,HaGAT1基因可能在油葵花器官发育中发挥重要作用,并且参与了油葵对干旱和高盐的抗性调节。     

白菜CesA基因家族鉴定及表达模式分析

为探究CesA基因家族在白菜生长发育及纤维素合成过程中的作用机制,该文通过生物信息学的方法,以白菜的全基因组序列为研究区域,进行理化特征、基因结构、进化特征、保守基序及结构域、顺式作用元件和组织表达等鉴定分析。结果表明:(1)共鉴定出16个编码纤维素合成酶亚基的CesA基因,该家族成员所编码蛋白的理论等电点为4.76～9.12,相对分子量为17.76～122.67 kD,长度为153～1 089 aa。(2)15个基因不均匀地分布于白菜的7条染色体上,Bra036008定位于scaffold上。(3)大部分成员包含4～14个外显子,1～11个保守基序。(4)该家族具有保守的DDD-QXXRW 保守功能域。(5)该家族编码蛋白主要分布在质膜上,二级结构以无规则卷曲与α-螺旋为主,多数成员都含有CesA蛋白典型的N端、C端和跨膜区。(6)CesA基因在茎中表达量相对较高,其中Bra011865、Bra023952和Bra029874在茎、叶、花中显著表达。该研究结果为后续深入研究CesA基因功能以及白菜生长发育研究奠定了基础。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

甘蓝型油菜BnTCP7基因的克隆和表达分析

该研究克隆获得了甘蓝型油菜预测转录因子TCP7-like同源编码基因,命名为BnTCP7,与甘蓝型油菜TCP7-like NC_027757基因的核苷酸序列相似性为95.68%。BnTCP7基因开放阅读框全长为648bp,编码215个氨基酸。BnTCP7氨基酸序列与十字花科(Brassicaceae)中其他19条TCP7或者TCP7-like氨基酸序列比对发现,BnTCP7与芸薹属和萝卜属等TCP7同源蛋白具有很强的相似性和保守性,尤其在靠近N端的TCP保守结构域,具有典型的螺旋-环-螺旋结构,且BnTCP7属于TCP家族Ⅰ类,为亲水性不稳定蛋白。通过BnTCP7和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTCP7(NC_003076)蛋白的二级和三级结构在线预测比对分析,进一步证实BnTCP7具有TCP家族典型结构。进化树分析表明,BnTCP7蛋白与甘蓝型油菜TCP7-like NC_027757蛋白聚在同一分支,两者亲缘关系最近。利用转录组数据对不同时期不同器官BnTCP7基因表达模式分析发现,其表达量呈现一定差异性,其中营养器官中的表达量高于生殖器官。非生物胁迫及激素处理对甘蓝型油菜幼苗植株中BnTCP7基因的表达影响分析发现,BnTCP7基因不仅响应了冷、热、损伤等非生物胁迫,而且参与了ABA和GA3激素的信号转导,表明BnTCP7基因在植物维持正常生长发育和逆境胁迫中可能发挥重要作用。     

小白菜BcUBCE2基因的克隆及表达分析

采用cDNA-AFLP和RACE技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶E2基因(ubiquitin conjugating enzyme E2),命名为BcUBCE2。序列分析表明,BcUBCE2基因cDNA全长830bp,包含1个456bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。结构分析发现,该序列包含一个泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析显示,小白菜BcUBCE2蛋白同拟南芥E2蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,BcUBCE2基因在小白菜根、茎、叶中均有表达,铜处理10d时BcUBCE2基因的表达量最高。研究认为,BcUBCE2基因可能在铜胁迫响应中发挥重要作用。     

甘蓝型油菜BnFLA基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了1个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(FLA),命名为BnFLA。BnFLA基因开放阅读框长为1 200bp,编码399个氨基酸,分子量为42 885.9Da,等电点为6.37。预测的BnFLA蛋白包含N-端信号肽、2个AGP-like结构域、2个fasciclin-like结构域和C-端GPI-anchor序列。系统进化分析表明BnFLA氨基酸序列与BrFLA17和AtFLA2进化关系较近,一致性分别为98%和87%。qRT-PCR分析表明,BnFLA基因在油菜各组织均有表达,并以下胚轴中表达量最高,其次为子叶,茎秆中表达最少;BnFLA基因的表达受到GA3、BR、IAA、ABA和NaCl的诱导,但受6-BA、蔗糖、低温和PEG抑制。研究认为,油菜中BnFLA基因可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答。