抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体 (HAMA)反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185 erbB2 人 /鼠嵌合抗体 ,将抗人P185 erbB2 单抗C2 5的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱动的选择标志基因的真核表达载体中 ,共转染CHO dhfr-细胞 ,经G418及氨甲喋呤 (MTX)梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达。采用RT PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化学等实验证实了所表达的抗人P185 erbB2 嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达 10 0mg/L ,所表达的嵌合抗体具有抑制P185 erbB2 高表达肿瘤细胞增殖的作用     

融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的构建及真核表达

本研究利用SWISS-MODEL预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR的方法分别从重组pPIC9k、重组pBullet和pSecTag2B上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv(简称A)、片段Fc-CD28-CD3(ζ)(简称B)和信号肽序列(简称S)。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段S-A-B。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,电转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在anti-erbB2 scFv与Fc基因片段之间不加连接肽的融合蛋白,在三级结构上可形成更佳的功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/S-A-B(在A与B基因片段之间不加linker)。经流式细胞术检测,在转染的Jurkat细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。本研究应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),融合基因能够在淋巴瘤T细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了实验基础。     

抗人CD3单链抗体四聚体基因的构建及表达

为构建和表达抗人CD3单链抗体 (scFv) 人p5 3四聚功能域融合基因 ,选用人IgG3上游铰链区作为抗人CD3scFv和人p5 3四聚功能域之间连接的linker .利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC18载体中构建pUC18 IgG3 p5 3克隆载体 .将抗人CD3scFv克隆入pUC18 IgG3 p5 3载体中 ,构建抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 .经酶切鉴定及序列测定证实后 ,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行亲和活性测定 .获得了抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 ,基因全长 882bp ,可编码 2 94个氨基酸 ,与已发表的抗人CD3scFv、人IgG3上游铰链区和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致 .表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 35kD的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞 ,亲和力高于scFv ,为进一步临床应用奠定基础     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器的制备与验证

目的:构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体并制备和验证抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法:利用PCR法扩增出抗人p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L,然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1,从而构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。分别将抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化,然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠,通过鼠尾直接PCR鉴定其转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果:经测序验证,抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠,且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L在它们的后代中稳定遗传,它们的后代中转基因小鼠双阳性率约为30%; RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示,转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达; Western blot和ELISA等实验结果显示,转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白质表达,而且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人κ链抗体和羊抗人Ig G Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论:成功构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L和制备了抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型,为今后抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因牛乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。     

抗人胎盘酸性铁蛋白单链抗体的构建、表达与鉴定

目的:制备人胎盘酸性铁蛋白(PAF),构建、表达并鉴定抗人PAF单链可变区抗体片段(scFv)。方法:设计以SfiⅠ、NotⅠ为酶切位点、以(Gly4Ser)3为linker的2对引物,从抗人PAF单克隆抗体可变区基因的克隆载体中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,构建VH-linker-VL的scFv基因。经SfiⅠ、NotⅠ酶切后克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化大肠杆菌TG1和筛选后测序验证,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量(Mr)。以人PAF为抗原,scFv为一抗,抗His单克隆抗体为二抗,间接ELISA鉴定其抗体活性。结果:重叠延伸PCR扩增产物经凝胶电泳可见约700bp的条带,DNA序列分析证明2株抗体具有完整的scFv序列,并含有c-myc和His。IPTG诱导阳性菌表达产物经SDS-PAGE鉴定有Mr约27000的显示条带,符合scFv与表达标签融合蛋白的理论值;间接ELISA证明表达产物可与PAF结合。结论:成功构建并表达了抗人PAF单链抗体,为进一步建立检测PAF的间接ELISA奠定了基础。     

人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达

本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体, 稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-I cDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35 cDNA, 重叠PCR法连接2个片段, 并克隆到IgG4(Fc)- pOptiVEC?-TOPO?载体上,对新构建的IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定; 脂质体法转染CHO/DG44细胞; RT-PCR检测转染结果, 采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞, 对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)的加压筛选, ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清, 免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆; SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带; 该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。     

DDR2结构域与人IgG Fc融合载体的构建、表达与蛋白纯化

目的:构建DDR2与人IgG Fc融合的分泌型真核表达载体,验证其表达,纯化具有生物活性的分泌型蛋白。方法:分析DDR2蛋白质结构功能域,设计载体构建策略;扩增DDR2胞外结构域片段,将其克隆至Psec Tag2B载体(带有人IgG Fc标签)中,在293T细胞验证其表达;用Protein G纯化柱纯化蛋白。结果:DDR2胞外结构域DS/Fc融合载体测序正确,转染293T细胞中后可成功分泌到细胞上清中,进一步用亲和层析法纯化得到高浓度蛋白。结论:重组载体特异性分泌DDR2胞外区蛋白,引入的Link序列是稳定分泌蛋白构象的基础,融合了人IgG Fc序列,可以作为DDR2配体拮抗剂靶向抑制DDR2与其天然配体的相互作用,对临床研究有重要作用。     

Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究

为了探讨人源抗甲型肝炎（甲肝）病毒scFv—Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体（scFv抗体）基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv—FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv—FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv—FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区（scFv）与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。     

抗人P185^erbB2嵌合抗体的CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体（HAMA）反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185^erbB2人／鼠嵌合抗体,将抗人P185^erbB2单抗C25的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱地劝的选择标志基因的真核表达载体中,共转染CHO－dhfr^-细胞,经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达,采用RT－PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化等实验证实了所表达的抗人P185^erbB2嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达100mg/L,所表达的嵌合抗体具有抑制P185^erbB2高表达肿瘤细胞增殖的作用。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.