龙眼胚性愈伤组织LEC1基因cDNA克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列...     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。     

龙眼胚性培养物APX同工酶的分析方法建立及其在龙眼体胚发生过程中的变化

以龙眼胚性培养物为材料,进行抗坏血酸过氧化物酶(APX)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法研究,建立一套适合分离龙眼胚性培养物中不同类型APX同工酶的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法;进一步研究了APX同工酶在龙眼体胚发生过程中的变化,发现在胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚3个阶段APX同工酶存在差异.     

龙眼体胚发生过程中的RNA研究初报

龙眼 ( Dimocarpus longan L our.)属无患子科 ( Sapindaceae)龙眼属 ,是起源于我国的一种重要热带、亚热带木本果树 .近 1 0多年来 ,赖钟雄等在前人 [1 ]的研究基础上 ,建立了龙眼体细胞胚胎高频率发生系统 ,这是在木本植物中最为优良的体胚发生系统之一 ,可作为木本植物体胚发生的模式系统 [2 - 6] .植物的体细胞胚胎发生的机理研究是目前植物细胞工程的前沿和优先发展领域 [7- 8] ,对于研究植物细胞全能性的机制、基因的表达和胚胎的发育具有重要意义 ;同时 ,由于体细胞胚胎发生过程与合子胚胎类似 ,即类似的分子机制调控着在体内 ( in…     

限制生长保存龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程的RAPD分析

以红核子龙眼不同保存时间(5个月、3 a、13 a)的不同发育阶段体胚为材料,对限制生长保存后的胚性愈伤组织(EC)的体胚发生过程进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析;筛选10条随机引物,对EC不同发育阶段体胚的基因组DNA进行扩增.结果表明:龙眼EC不同发育阶段体胚的RAPD谱带存在一定的差异,但不同保存时间的EC在体胚发生过程中的相对变异率都保持在比较小的变异范围内,小于5.1%.     

金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其体胚发生过程中的表达分析

以金花茶胚性培养物为材料,对体胚PPO基因克隆以及在体胚发生过程中的转录水平进行q PCR分析和酶活性变化检测.结果表明:克隆获得的金花茶PPO基因c DNA序列1788 bp,含有完整的开放阅读框(ORF),编码595个氨基酸;与登录Gen Bank的山茶属其他植物PPO基因序列进行核苷酸和氨基酸比对发现,同源性分别为74%和72%左右.同时,以18S rRNA作为内参基因进行的q PCR分析表明:金花茶体胚发生过程中PPO基因表达量呈下降趋势,球形胚PPO基因表达量最大,子叶胚和心形胚次之,成熟胚最小;而正常子叶胚和花状多子叶胚的表达量存在明显差异.此外,对金花茶体胚发生过程中PPO活性变化检测结果表明:在此过程中PPO活性明显比较低,变化趋势与PPO基因定量表达结果相似,推测PPO基因可能在金花茶体胚发生早期发挥重要作用.     

龙眼TFL1基因的克隆与表达

以‘红核子’龙眼叶芽为材料,克隆了龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的c DNA序列和基因组DNA序列,进行序列分析,并对这两个基因在花芽分化过程中的表达进行了研究.结果显示,龙眼TFL1-1基因c DNA开放阅读框共519 bp,编码173个氨基酸,TFL1-2基因c DNA开放阅读框共525 bp,编码175个氨基酸;两个基因DNA序列均含有4个外显子和3个内含子;序列分析和系统进化树分析表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2都是TFL1同源基因,龙眼TFL1-1基因与柑橘、梨的TFL1基因亲缘关系较近;基因表达结果表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的功能都与抑制花芽分化有关.     

龙眼体胚发生过程中tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)的克隆及表达分析

根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库信息,进行龙眼胚性愈伤组织tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)cDNA全长克隆及其在体胚发生过程中的定量表达分析.结果表明:Dltyw1基因全长2273 bp,包含1920 bp ORF,编码640个氨基酸,将此基因登录GenBank,登录号为JF733783;Dltyw1含有flavodoxin 1、Radical SAM及Wyosine form功能域,进化树分析显示,Dltyw1与其他物种twy1基因具有较高同源性.荧光定量PCR技术分析表明,Dltyw1基因在龙眼体细胞心形胚时期呈现表达高峰,并在子叶形胚阶段迅速下降至最低点,由于心形胚是体细胞胚胎发生由球形胚向各组织器官发育的关键阶段,表明twy1基因在体胚发生过程中的组织器官发育及形态建成阶段的转录后调控方面起重要作用.     

龙眼体胚发生中期发育同步化的初步调控

试验以龙眼"红核子"胚性愈伤组织为材料,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控,2,4-D浓度为0.07mg/L时获得了心形胚,2,4-D浓度为0.05mg/L和0.06mg/L时获得了鱼雷形胚,2,4-D浓度为0mg/L时获得了高度同步化的子叶形胚。研究表明,通过培养基中2,4-D浓度的微量调整,基本能够控制龙眼体胚发育中期心型、鱼雷形胚的发育同步化。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中特异表达蛋白的双向电泳分析

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系为材料,进行体细胞胚胎(简称体胚)发生及其同步化调控,获取体胚发生过程中各个主要发育阶段的培养物(胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚),采用双向电泳对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析.结果表明:(1)龙眼胚性愈伤组织中,pI为4-5的酸性蛋白表达种类最多,在体胚发育的过程中逐渐消失,相反,pI为5-6的微酸性蛋白的表达逐渐增多;(2)体胚发育后期,尤其是成熟胚晚期,分子质量大的蛋白大量减少,分子质量较小的蛋白增多并逐渐积累;(3)虽然在各个发育阶段都会出现一些新的特异蛋白,但是没有改变蛋白质种类逐渐减少的趋势;(4)发现了一些有差异的特异蛋白点,尤其是成熟胚后期,有一系列大分子质量的蛋白消失,新出现了一部分分子质量较小的蛋白,其中几种表达量很大,可能与体胚发育有密切关系.     

龙眼体胚Myb转录因子基因的克隆及序列分析

以龙眼同步化调控的鱼雷形胚为材料,设计特异上下游引物,采用RT-PCR法,获得了797 bp的基因序列.通过NCBI的BLAST软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性搜索及相似度分析,结果表明,所获得的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的Myb转录因子有较高的同源性,推断该基因序列属于龙眼Myb转录因子基因.已在G...     

龙眼体细胞胚胎发生过程中内源多胺的变化

采用高效液相色谱测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中内源多胺含量的变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织中内源多胺含量比非胚性愈伤组织高;体胚发生过程中内源多胺含量变化趋势大致呈“M”状,在胚性愈伤组织Ⅱ和球形胚阶段转折;内源多胺含量的变化先于形态学的变化.