人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

FSHB启动子基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

目的 克隆人卵泡刺激素β亚基(Follicle Stimulating Hormone β-subunit,FSHB)的启动子;构建FSHB启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法 设计合成FSHB启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增FSHB启动子序列;将扩增片段插入载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至PGL6-TA荧光报告基因载体;瞬时转染进Hela细胞,收集细胞裂解液后,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果 PCR扩增得到人FSHB基因启动子;成功构建pGL6-FSHB-promoter报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.通过荧光素酶相对表达效率比较,在Hela细胞的体外实验中发现,FSHB-211G→T突变后荧光素酶表达具有更高的效率,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建人FSHB基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究FSHB转录表达的调控机制提供基础.     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

载脂蛋白M基因启动子克隆及功能初步研究

目的克隆apoM基因的上游启动子序列,构建启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因,并观察其不同截短片段的启动子活性,为进一步研究apoM基因的表达调控机制奠定基础。方法在对apoM基因生物信息分析的基础上,采用5’RACE确定了apoM基因的转录起始点,构建了6种不同长度apoM基因启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic(A-F),将它们瞬时转染HepG2细胞,并检测其荧光素酶活性。结果 pGL3-Basic-C的荧光素酶活性最高。结论 -401～-621bp可能是apoM的核心启动子区。     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

靶向血管内皮生长因子和神经生长因子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,构建靶向血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）双基因的短发夹RNA（short hairpin,shRNA）真核表达载体用于胶质瘤基因治疗。方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BglⅡ—HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游,构建shRNA重组质粒,进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达。结果重组质粒经过酶切鉴定和测序,插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致,在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达。结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术,研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的鉴定

目的构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位。生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果成功构建含有新启动子的重组质粒。与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363bp至-63bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点。结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363bp至-63bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控。     

人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测

目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒。用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达。同时,将上述MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2 A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达。结果重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白;pGL3-MANF-5F重组质粒在N2 A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论已成功克隆了MANF基因的5'端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103T/C多态性对基因转录活性的影响

目的探讨人多巴胺D2受体（DRD2）基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性（rs2075652）对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列（399 bp）,51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmir Glo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmir Glo-T/pmir Glo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时（P〈0.01）。结论成功构建了pmir Glo-T/pmir Glo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达

目的 克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞。方法 用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切（PstI BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株。结果 成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞。经流式细胞仪检测：PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97．6％。结论 构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株。     

一种新的链霉菌表达载体启动子

eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用。本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒。PEG介导原生质体转化法将穿梭型质粒分别转入糖多孢红霉菌A226与变铅青链霉菌JT46,荧光显微镜检测发现,此启动子在两菌株中都具有功能。随后,以变铅青链霉菌JT46为宿主,对PeryA启动子区域进行了深入研究,结果发现该启动子的-35区并不是必需的,仅有-10区、长度为41bp的该启动子在链霉菌中仍具有功能。定点突变证明-10区对于该启动子是必不可少的。因此,41bp的该启动子片段可作为链霉菌的有效启动子,这是迄今为止所发现的最短的启动子之一,可用于构建新的链霉菌表达载体。