对TRAIL耐药的肝癌细胞caspase-8基因甲基化状态及其mRNA表达

目的研究肝癌细胞株HepG2和SMMC 7721对肿瘤坏死因子相关与凋亡诱配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的敏感性与caspase-8基因启动子区5′CpG岛的甲基化状态和mRNA表达的关系及5′-氮-2′-杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对TRAIL抗癌活性的影响.方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR method, MSP)方法检测caspase-8基因5′CpG岛甲基化状态;采用RT-PCR方法检测caspase-8 mRNA表达;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色方法检测细胞凋亡.结果 2株肝癌细胞均属TRAIL耐药细胞,caspase-8基因5′CpG岛均为非甲基化状态; 5-Aza-CdR即不能增加caspase-8 mRNA表达,亦不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.结论肝癌细胞对TRAIL的敏感性与caspase-8基因的甲基化状态及mRNA表达无关,5-Aza-CdR不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路.方法 将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR (MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达.结果 在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P＜0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P＜0.05).结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生.     

肝细胞性肝癌细胞因子信号1抑制因子基因的甲基化状态

背景:曾有报道在肝细胞性肝癌(HCC)中编码区CPG岛异常甲基化导致细胞因子信号1抑制因子(SOCS-1)沉默。但是,甲基化主要发生于5'端非编码区而非基因表达调控的编码区。方法:取22份HCC组织标本及22份癌旁非HCC组织作为研究对象,采用甲基化特异PCR检测5'端非编码区和SOCS-1CPG岛的甲基化状况。结果:使用CPG岛引物发现,22份HCC中9份存在异常甲基化,而22份癌旁非HCC组织中仅有1份。在22份HCC中1份、22份癌旁非HCC组织中5份检测到非甲基化。SOCS-1异常甲基化与HCC显著相关(Fisher精确检验,P=0.0076)。使用5'端非编码区引物发…     

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平.结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强.结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.     

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。     

豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆

目的克隆豚鼠钙调蛋白2(Ca M2)基因编码区及3′端非编码区,为豚鼠Ca M基因功能等研究提供遗传学信息。方法以豚鼠心肌组织作为实验材料提取RNA,通过RT-PCR和3′-RACE PCR的方法扩增Ca M2的编码区和3′端非编码区序列,应用基因工程技术插入克隆载体构建重组质粒后基因测序及分析。结果克隆出豚鼠Ca M2基因编码区450 bp序列和3′端非编码区660 bp序列。分析编码区序列所编码的氨基酸序列与其他种属其他亚型完全一致。而3′端非编码区与其他亚型的同源性较低。结论成功获得了豚鼠Ca M2基因编码区和3′端非编码区序列,为进一步研究Ca M2的基因功能及其在相关疾病中的作用奠定基础。     

全反式维A酸对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因甲基化影响的研究

目的:全反式维A酸是一种经典的诱导肿瘤细胞分化的药物,但关于其对肿瘤细胞的异常甲基化的影响,国内研究仍很少,文中通过观察全反式维A酸(ATRA)对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因启动子甲基化位点的影响,及其对RARa基因mRNA表达的影响,探讨ATRA对RARa基因启动子区异常甲基化可能的作用. 方法:用不同浓度及作用时间的ATRA体外干预COC2细胞,甲基化特异性PCR及基因测序法检测用药前后COC2细胞中RARa启动子区甲基化状态的改变.RT-PCR法检测各组RARa基因mRNA表达的改变. 结果:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常甲基化;不同浓度ATRA处理后,RARa启动子的异常甲基化位点出现部分逆转,并在一定范围内表现出浓度及时间依赖性,RARa基因的mRNA表达也同样表现为增高趋势. 结论:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常高甲基化;ATRA可以部分逆转RARa启动子区的异常甲基化位点并增加RARa mRNA的表达.     

胃癌中MTS1基因异常甲基化的研究

【目的】探讨多肿瘤抑制基因 (multipletumorsuppressorgene 1,MTS1) 5′端CpG岛异常甲基化与原发性胃癌发病机制之间的关系。【方法】PCR 甲基化检测法研究 31例胃癌标本和 19例正常胃组织中MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化情况。【结果】有 35 5 % (11/ 31)的胃癌标本和 5 3 % (1/ 19)正常胃组织出现MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化 ,两者之间有显著性差异 (P <0 0 5 )。【结论】MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化是其在原发性胃癌中的主要灭活机制 ,与胃癌的发生发展密切相关。     

ATRA对三阴性乳腺癌细胞CDH1表达的影响

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231的CDH1表达的影响及可能机制.方法 实验分空白对照组(control)、5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)组及ATRA组,分别用甲基化特异性PCR(MSP)、逆转录PCR(RT-PCR)方法检测MDA-MB-231细胞CDH1基因启动子区甲基化状态及mRNA表达情况.结果 空白对照组MDA-MB-231细胞CDH1基因启动子区处于甲基化状态,CDH1mRNA无表达,而5-Aza-CdR组与ATRA组CDH1基因启动子区处于非甲基化状态,CDH1 mRNA表达明显上调,且两组之间无明显差别.结论 ATRA能够通过去甲基化机制上调MDA-MB-231细胞CDH1基因的表达.     

５ 氮杂 ２′ 脱氧胞苷诱导肝癌细胞株ＳＬＩＴ２基因去甲基化的实验研究

目的：观察肝细胞癌（HCC）细胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后,其启动子区甲基化状态及表达的变化,探讨HCC细胞株中SLIT2基因调控规律及甲基化调节抑制剂5-Aza-CdR对SLIT2基因转录的影响。方法对上述 HCC 细胞株体外培养,MSP法检测 HCC 细胞株中 SLIT2启动子相关区域的甲基化状况。应用10 mmol／L浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的5种HCC细胞后,MSP法检测用药前后细胞中SLIT2基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞中SLIT2 mRNA的变化。结果 SLIT2基因在各细胞株中启动子区呈异常高甲基化状态,mRNA低表达。经过5-Aza-CdR处理后,SLIT2基因启动子区呈显著去甲基化状态,其mRNA表达增强。结论启动子区异常甲基化是HCC细胞SLIT2基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转SLIT2基因甲基化状态,从而调控SLIT2基因表达。     

上皮性钙黏素及其基因启动子区甲基化与葡萄胎恶变关系

目的研究上皮性钙黏素(E-cadherin)及其基因启动子区CpG岛甲基化在葡萄胎恶变中的作用,探讨去甲基化制剂5′-氮杂-2′脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导绒癌细胞株中E-cadherin基因恢复表达的可能性。方法采用免疫组化SP法,检测10例正常早孕绒毛和37例葡萄胎组织中E-cadherin的表达。采用甲基化特异性PCR(MSP)检测正常早孕绒毛、非恶变葡萄胎、恶变葡萄胎及绒癌细胞株JAR中E-cadherin基因CpG岛的甲基化状态,并用RT-PCR检测绒癌细胞株JAR经5-Aza-CdR处理后E-cadherin mRNA表达。结果正常早孕绒毛、非恶变葡萄胎、恶变葡萄胎组织E-cadherin蛋白表达阳性率及甲基化率分别为100%、90.00%、41.18%和0、15.00%、41.18%,差异均有显著性(χ2=12.903、4.573,P0.05)。E-cadherin蛋白表达在甲基化组低于非甲基化组(Ken-dall tau-b=0.769,P0.05),且恶变葡萄胎组织中E-cadherin基因甲基化率与解剖学分期、预后评分有关(Kendalltau-b=-0.757、-0.663,P0.05)。在JAR细胞株中E-cadherin基因启动子区呈甲基化状态,且其mRNA弱表达,经5-Aza-CdR处理后的JAR细胞株E-cadherin mRNA表达明显增强。结论 E-cadherin基因启动子区过度甲基化可能是E-cadherin失活的机制之一,与葡萄胎的恶性进展有关。5-Aza-CdR能逆转JAR细胞株中E-cadherin基因甲基化状态,从而恢复E-cadherin基因的转录活性。     

垂体腺瘤组织中ASPP2 mRNA和Ki-67蛋白的表达

目的:研究垂体腺瘤组织中ASPP2基因mRNA和Ki-67抗原的表达情况.方法:收集垂体腺瘤手术标本71例(其中侵袭性垂体腺瘤36例,非侵袭性垂体腺瘤35例; 病理分型包括生长激素腺瘤14例,泌乳素腺瘤13例,促肾上腺皮质激素腺瘤5例,促性腺腺瘤7例,无功能腺瘤10例,多激素腺瘤22例),采用RT-PCR方法检测垂体腺瘤标本中ASPP2基因mRNA的表达情况,采用免疫组织化学方法检测垂体腺瘤石蜡切片中Ki-67抗原的表达情况,并分析二者的相关性.结果:71例垂体腺瘤手术标本均有ASPP2基因mRNA和Ki-67表达,不同病理类型间ASPP2基因mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);但不同病理类型间Ki-67 LI差异有统计学意义(P<0.05).非侵袭垂体腺瘤和侵袭性垂体腺瘤组织中ASPP2 mRNA的表达和Ki-67 LI差异均有统计学意义(P<0.05);ASPP2基因表达水平与Ki-67 LI呈负相关(r＝-0.256,P<0.05).结论:人垂体腺瘤组织中ASPP2基因的表达与其细胞增殖活性和侵袭性行为有关,可以作为判断垂体腺瘤侵袭性和预测复发的有效临床检测指标.     

5-氮-2'-脱氧胞苷及TSA对人结肠癌细胞株HT29 ING1b基因表达的影响

目的 探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-dc,以下简称Aza)及组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达.结果 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低.经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1b mRNA表达亦比对照组高.结论 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长.     

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系.方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达.结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调.结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节.     

5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖及RUNX3基因启动子区甲基化状态的影响

目的：探讨5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖及其抑癌基因RUNX3启动子区甲基化状态的影响。方法：应用MTT法观察5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖的抑制能力;采用甲基化特异性PCR（MSP）检测5-氮-2＇脱氧胞苷干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR检测干预前后RUNX3基因的mRNA表达水平的变化。结果：经5-氮-2＇脱氧胞苷处理后,RUNX3基因启动子高甲基化的区域发生部分去甲基化,5-氮-2＇脱氧胞苷处理前启动子高甲基化的RUNX3 mRNA未见表达,而在其处理后该基因可见重新表达,经5-氮-2＇脱氧胞苷处理后,Reh细胞生长缓慢。结论：5-氮-2＇脱氧胞苷能使Reh细胞RUNX3基因启动子区发生部分去甲基化,从而调控RUNX3基因表达并能抑制其细胞生长。启动子区异常甲基化是白血病Reh细胞RUNX3基因失活的主要原因之一。     

WIF-1、DKK基因启动子甲基化对COLO 320、

目的 探讨Wnt抑制性基因甲基化对结直肠癌细胞株Wnt/β-catenin信号通路的影响。 方法 使用甲基特异性PCR和逆转录实时定量PCR方法,分别检测结直肠癌细胞株COLO 320、HT-29及正常细胞株CCD-18Co中WIF-1、DKK-1、DKK-3的启动子CpG岛甲基化、mRNA水平,和测定β-catenin蛋白磷酸化情况,并观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-dC）去甲基化对各指标的影响。 结果 COLO 320细胞的DKK-1及DKK-3 mRNA水平明显降低、甲基化程度高;HT-29细胞的DKK-3、WIF-1 mRNA水平低、甲基化程度高;两个肿瘤细胞株的β-catenin蛋白总量均明显增高,且主要为非磷酸化的状态。5-aza-dC可减少这些指标的改变。 结论 抑制性基因甲基化调节的Wnt/β-catenin通路的异常激活,可能在结直肠癌的形成中有重要作用。在不同的肿瘤细胞株之间、不同Wnt抑制基因的甲基化程度存在差异;该领域的深入研究有助于开发出新的治疗药物。     

肝癌细胞中WIF-1的甲基化状态分析

目的探讨WIF-1基因在肝癌细胞中的甲基化状态及其与蛋白表达的关系,并初步研究了WIF-1与肝癌发生发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)和测序方法分析了9种肝癌细胞系中WIF-1启动子区的甲基化状态,用RT-PCR检测了其mRNA的表达。用去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理肝癌细胞株并分析其mRNA和蛋白的表达的变化。结果6种肝癌细胞中检测到异常的甲基化,甲基化率为66.7%。在用5-Aza-CdR处理细胞后,WIF-1表达缺失的肝癌细胞系不同程度地恢复了表达。MTT法分析发现WIF-1对SMMC-7721(7721)细胞生长有较为显著的抑制效果。结论推断WIF-1启动子区频繁甲基化的现象可能是它在肝癌中表达沉默的主要机制,并在肝癌的发生发展起作用。     

改造IFNα—2b基因3′端提高其在大肠杆菌中表达水平

目的：对人ＩＦＮα－２ｂ基因的５′端进行改造,从翻译水平上调控ＩＦＮα－２ｂ基因在大肠杆菌中的表达。方法：采用ＰＣＲ方法,人工合成寡核苷酸引物,对人ＩＦＮα－２ｂ基因进行了改造：去除３′端非编码区,并增加原核系统强终止密码子。将改造后的基因片段分别克隆入原核表达载体ｐＢＶＦ３２１,在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果：３′端删除非编码区,表达水平比删除前提高４倍。结论：ＩＦＮα－     

The expression of WWOX and p73 in acute myeloid leukemia

目的 研究WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)和p73基因在急性髓细胞白血病(AML)中异常表达的临床意义及其机制.方法 收集AML患者骨髓58例,非白血病患者骨髓31例作为对照组,采用RT-PCR检测WWOX和p73基因mRNA的表达情况、甲基化特异性PCR检测WWOX基因启动子区和p73基因第一外显子区的甲基化情况.结果 58例AML患者中,28例WWOX基因mRNA阳性表达,30例p73基因mRNA阳性表达;23例WWOX基因启动子区存在甲基化,21例p73基因第一外显子区存在甲基化.对照组中WWOX与p73基因mRNA均有表达29例,均未见甲基化现象.WWOX和p73基因在AML中mRNA的表达以及甲基化状态与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 WWOX与p73基因的甲基化可能导致其基因的沉默,使其mRNA表达减少或缺失,在AML的发病机制中起一定作用,WWOX与p73基因甲基化的检测对AML的诊断和疗效有一定意义.     

3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。