一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应(PCR)技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21μm的液滴.利用"玻璃天花板"的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10¹～10⁵copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R²=0.998).该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.     

微流控PCR芯片的研究进展

基因是人类的遗传密码,人类个体之间只有万分之一的基因不相同,却导致了人与人之间丰富的差异.了解这种差异对于科学研究具有巨大的应用价值.PCR是基因研究中常用的手段之一,但传统PCR仪存在反应时间长、能量消耗大、不便于集成与携带等缺陷,微流控技术与PCR结合可以有效缩小反应体系,提高反应效率,且易于集成化与微型化.本文按照微流控PCR芯片的结构分类,详细介绍了微池型、连续流动型PCR芯片,以及电泳、荧光、电化学和DNA杂交阵列等检测方法,并在最后进行了总结与展望.     

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.     

负压驱动皮升级等温核酸精确定量微流控芯片

精准医疗急需更加精确、灵敏、方便快捷的核酸定量方法。设计开发了一种结合双荧光等温扩增的高密度皮升级核酸定量微流控芯片。芯片采用多层软光刻技术制成,有3个反应通道,每通道有40 000个反应小室,共120 576个皮升级反应小室,反应小室的密度达7 000/cm~2。芯片利用负压驱动样品精确分配,热凝固油相封闭小室,无需阀门及其他仪器辅助。芯片中嵌入的氟硅烷纳米涂层能有效地阻止反应过程中水蒸气的散失。以乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)质粒作为模板,进行等温多底物自配引发扩增(isothermal multiple self-matchinginitiated amplification,IMSA),测试芯片定量性能。芯片检测模板的动态范围达6个数量级,可检测的最大模板量为36μL中1.13×10~6拷贝数核酸。该装置具有定量精确、灵敏、快捷、操作简单等优势,可用于精准检测。     

基于微流控芯片的核酸提取技术研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的大肆传播对世界各国公共卫生防护能力与医学检测能力发起了严峻的挑战.快速、准确、灵敏的核酸扩增检测成为了当前的研究热点,而如何从复杂的生物样品中提取高纯度的核酸对保证核酸分析检测的灵敏度和准确性起着至关重要的作用.然而传统的核酸提取方法耗时长且通常需要复杂的设备,利用微流控芯片的集成...     

基于微流控芯片的微阵列分析

微阵列芯片具有高通量、微量化和自动化等特点,已经在很多领域得到广泛应用。但是微阵列芯片仍然具有不足之处,如所需设备昂贵、分析时间较长、灵敏度不高、多样品平行分析能力不足等。微流控芯片微米级的通道具有相对较大的比表面积和较短的扩散距离,能够显著加快分析速度、提高检测效率、增强分析性能,并且能够加工大量的平行通道用于多样品分析。目前已经有大量文献报道将微流控芯片和微阵列芯片相结合,发展了独特的杂交方式并在实验和理论上分别证明了两者相结合的优势,本文综述了将微流控芯片技术应用于微阵列分析的研究进展,着重介绍了在微流控芯片上进行微阵列分析时的杂交方式、促进杂交的措施以及杂交过程的数学建模,同时也介绍了其他分析步骤方面的进展。最后分析了目前微流控芯片技术在进行微阵列杂交应用方面的不足及其原因,并指出这两项技术相结合的优势和未来。     

微流控芯片细胞实验室

以作者所在课题组近年开展的研究工作为基础,阐述了微流控芯片细胞实验室的平台特征,并从细胞个体、群体和多细胞生命体研究等三个方面概述微流控芯片细胞实验室的应用对象特征,显示其在生物医学领域的应用前景。     

微流控芯片二维电泳研究进展

综述了微流控芯片二维电泳技术及其在生命科学中的应用,包括胶束电动力学毛细管色谱(MEKC)与毛细管区带电泳(CZE)、等电聚焦(IEF)与CZE、开管电色谱(OCEC)与CZE耦联等模式的二维微流控芯片。展望了二维微流控芯片的应用前景。     

数字聚合酶链式反应技术及其在疾病检测中的研究进展

数字聚合酶链式反应（Digital polymerase chain reaction, d PCR）技术是通过将反应体系均分到数万个独立的PCR反应单元进行单分子级扩增,并结合泊松分布实现单拷贝核酸分子精确定量分析的PCR技术。dPCR技术具有灵敏度高、无需标准曲线等优势,被广泛应用于疾病检测领域。随着阶梯乳化和三维成像等技术的引入,dPCR技术在检测精度、多重检测和检测速度等方面得到极大改进,显著提升了其临床疾病诊断性能。本文追溯了dPCR技术的发展历程,对其在肿瘤和感染等疾病检测中的应用进行了综述,分析了dPCR技术发展存在的挑战与机遇,以期为dPCR技术未来的开发利用提供参考,推动临床检验分子技术高质量发展。     

流动型微流控PCR扩增芯片的研究

组装了由注射泵进样系统、微流控芯片和三温区加热器组成的流动型PCR扩增系统,该系统具有扩增速度快、交叉污染小、芯片可重复使用和操作方便等特点.优化了芯片厚度、隔热材料和流速等影响PCR扩增的因素.在4.9min内经24个循环成功地扩增了浓度为1ng/100μL的λ-DNA(500bp).     

数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展

近年来,微纳尺度流体控制技术由于具备实现多相、多步和平行反应的优势,已成为传统分析手段的首选的补充和替代方法.其与核酸扩增方法的完美结合,有效推动了数字核酸扩增检测(Digital nucleic acid detection,dNAD)技术的建立与发展.作为可实现单分子水平检测的分析方法,dNAD技术已成为分子诊断领域重要的组成部分.本文回顾了dNAD技术的发展历程,阐述了其检测原理,以及相比于传统方法的优势,对其最新研究与应用进展进行了综述,并对其未来的发展进行了展望.     

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合,在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭,具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模,使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片,与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0~10 mL/min)的驱动控制装置、温控精度可达0.1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品,采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行,以2 mL/min的流体驱动速度完成20μL裂解液上样、清洗;以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱,抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象,并以传统手工提取为对照,在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示,扩增曲线明显,Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致,均为89.9℃。结果表明,此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。     

Rapid Absolute Determination Platform of Nucleic Acid for Point-of-care Testing

Nowadays nucleic acid tests are promising to be considered as point-of-care testing(POCT). However, no such devices are currently available that can perform all the functions, including absolute nucleic acid determination, worldwide on-site detection, rapid analysis and real-time results reporting via ubiquitous mobile networks simultaneously with full package and automated means of measurement. In this study, we presented a compact low-cost portable POC automated testing platform with all attributes mentioned above. A disposable self-priming compartmentalization(SPC) microfluidic chip is used to conduct isothermal amplification. The platform also includes a micro-computer controlled heating unit, an inexpensive optical imaging setup, and a mobile device with customized software. It may become a useful tool for the rapid on-site detection of infectious diseases as well as other pathogens.     

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重PCR扩增产物。优化了多重PCR扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件。当芯片电泳的筛分介质HPMC-50浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmol/L、电场强度为120 V/cm时,pUC Mix DNAMarker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%~2.09%。本方法能够检出1×102cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌O157:H7和志贺菌。方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段。将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义。     

PCR生物微流体芯片中的表面钝化技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种重要的体外DNA扩增技术,在生物化学、分析化学以及分子生物学等领域中得到广泛的应用．基于微电子机械系统（Microelectromechanical system,MEMS）技术构建而成的PCR生物微流体芯片由于具有反应速度快、样品消耗少以及所占空间体积少等优点而倍受人们亲睐．然而,伴随之较大比表面积以及其所用的裸露衬底材料常常抑制PCR反应,从而导致PCR不能顺利进行．本文结合本试验室的研究工作,综述了PCR生物微流体芯片中为了获得“友善”的PCR扩增体系而采取的表面钝化技术,主要包括表面钝化的必要性、静力学／动力学表面钝化技术以及硅相关材料对PCR抑制的机制等等．     

Molecular Methods for Identification and Quantification of Foodborne Pathogens

Foodborne pathogens that enter the human food chain are a significant threat worldwide to human health. Timely and cost-effective detection of them became challenging for many countries that want to improve their detection and control of foodborne illness. We summarize simple, rapid, specific, and highly effective molecular technology that is used to detect and identify foodborne pathogens, including polymerase chain reaction, isothermal amplification, loop-mediated isothermal amplification, nucleic acid sequence-based amplification, as well as gene chip and gene probe technology. The principles of their operation, the research supporting their application, and the advantages and disadvantages of each technology are summarized.