冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种的筛选

目的筛选冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种。方法将原代地鼠肾细胞传毒种(北京固定毒7aG)和豚鼠脑传毒种(北京固定毒6aG4)平行接种于10层细胞工厂培养的原代单层地鼠肾细胞,收获病毒液,共收获8次,1、3、5、7、9号细胞工厂接种脑毒,2、4、6、8、10号细胞工厂接种细胞毒。1次收获(简称1收)培养72h,从2次收获(简称2收)开始,培养24h,收获液经超滤浓缩、柱层析纯化、除菌过滤、再浓缩配制成人用狂犬病疫苗半成品,检测各项指标,筛选最佳毒种。结果6aG4株毒种制备的病毒收获液、浓缩液、纯化液、纯化除菌过滤液、狂犬病疫苗半成品的各项检定指标都优于7aG毒种。结论豚鼠脑传毒种(6aG4)明显优于原代地鼠肾细胞传毒种(7aG),选择豚鼠脑传毒种(6aG4)作为人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种。     

生物反应器培养Vero细胞制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗

目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。     

双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)的纯化工艺

目的　研究肾综合征出血热抗原的纯化工艺。方法　用Vero细胞繁殖肾综合征出血热病毒 ,经过灭活、浓缩 ,Sepharose 4FF凝胶过滤纯化。结果　用Sepharose 4FF柱层析纯化时 ,2 80nm监测收集到 3个吸收峰 ,其中第 1峰为抗原峰 ,将第 1峰稀释配制后进行动物实验 ,表明按照该工艺制备的Vero细胞纯化疫苗安全有效。结论　本研究为肾综合征出血热纯化疫苗的研制奠定了基础。     

带状疱疹疫苗生产中2BS细胞细胞工厂培养工艺的建立

目的建立带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺。方法将2BS细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行细胞计数。取细胞工厂,按MOI 0.008接种水痘-带状疱疹病毒,制备成带状疱疹减毒活疫苗,检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验;采用酶联免疫法检测抗生素残留量和牛血清白蛋白残留量;凝胶法检测内毒素含量;水分容量滴定法检测水分含量。结果 2BS细胞按1∶2比例传代,细胞工厂单层加液量为300 ml,可制备单层致密、优质的细胞,细胞工厂收获时细胞病变达80%以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,且1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃稳定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6 lg PFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求。结论建立了带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺,利用细胞工厂可制备出质量均一、致密优质的2BS细胞。     

应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。     

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。     

应用区带离心法纯化地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用区带离心法纯化原代地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗。方法浓缩的原代地鼠肾细胞乙脑灭活疫苗,经36％和60％不连续蔗糖密度、23 000r/min离心4h后,收取纯化的乙脑抗原组分,制成纯化乙脑疫苗。结果浓缩疫苗经一步区带离心纯化后,抗原效价提高3倍以上,蛋白去除99.5%以上。经稀释制成的半成品疫苗与未经浓缩的原疫苗相比,抗原效价提高4倍以上,蛋白去除99％以上。结论区带离心法可用于纯化地鼠肾细胞乙脑疫苗。     

水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2～3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。     

两种不同培养工艺制备森林脑炎灭活疫苗的免疫原性及安全性评价

目的评价细胞工厂工艺制备森林脑炎灭活疫苗的免疫原性及安全性。方法利用10 L转瓶和细胞工厂两种工艺在地鼠肾细胞上培养森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV),收获病毒液,经病毒灭活、超滤浓缩、柱层析纯化、除菌过滤后,制备森林脑炎灭活疫苗。采用透射电子显微镜及SDS-PAGE对病毒进行形态观察及鉴定。将两种工艺共制备的6批疫苗免疫小白鼠,评价疫苗的免疫原性;通过家兔刺激试验及豚鼠主动过敏性试验评价疫苗的安全性。结果两种工艺共制备的6批疫苗原液,透射电镜下观察均可见约为50 nm的圆形病毒颗粒,SDS-PAGE分析均可见相对分子质量分别为50 000和40 000~45 000的蛋白条带,病毒形态及蛋白条带大小均与TBEV相符;免疫保护指数均大于1. 0×10~5,符合《中国药典》三部(2015版)标准;家兔刺激试验对注射部位无刺激性,豚鼠主动过敏试验无小鼠出现过敏性反应。结论细胞工厂工艺和10 L转瓶工艺制备的森林脑炎灭活疫苗均具有良好的免疫原性及安全性。     

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

肠道病毒71型在Vero细胞中培养条件的优化

目的优化肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在Vero细胞中的培养条件。方法分别采用吸附法和直接接种法将EV71接种于Vero细胞中进行增殖,检测病毒滴度;选择最佳接种方法接种病毒,考察血清浓度、收毒方式、病毒接种量(MOI)和收毒时间对病毒滴度的影响。结果将MOI为0.02～0.2的病毒直接接种于不含血清的培养基中,培养60 h,胞外收毒,可获得较高的病毒滴度。结论优化了EV71在Vero细胞中的培养条件,为EV71的大规模培养及其疫苗研发奠定了基础。     

以MDCK为基质的H5N1流感全病毒灭活疫苗的制备及其免疫学评价

目的利用生物反应器培养技术大规模制备以MDCK细胞为基质的H5N1流感全病毒灭活疫苗,并进行免疫学评价。方法利用7.5 L生物反应器,以5 g/L微载体培养MDCK-G1细胞,当细胞密度达到1.5×106或2.5×10^6个/mL时,以0.001、0.0001、0.00001 MOI接种H5N1流感病毒,每12 h取样检测流感病毒血凝滴度,并观察细胞形态;利用40 L生物反应器进行放大培养,收获病毒液后进行纯化。以不同剂量的细胞基质和鸡胚基质流感疫苗免疫BALB/c小鼠及攻毒,检测免疫原性。结果当细胞密度达1.5×10^6个/mL时,以0.0001 MOI接种H5N1流感病毒48 h后,流感病毒滴度可达1∶1024。纯化后病毒液杂蛋白去除率为91.2%,回收率为87.9%,总蛋白与HA比值低于4.5,符合《中国药典》三部(2015版)相关规定。各剂量组细胞基质疫苗血凝抑制试验中和抗体滴度略高于鸡胚基质疫苗,其中10μg剂量组差异无统计学意义(P>0.05),0.1μg剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。细胞基质疫苗及鸡胚基质疫苗组小鼠体重均有下降再恢复的过程,二者对小鼠体重的影响差异不大;1、0.1μg剂量组细胞基质疫苗保护率为80%和40%,高于鸡胚基质疫苗的70%和30%,但差异均无统计学意义(P>0.05),10μg剂量组均为100%。结论建立了以MDCK细胞为基质的H5N1流感病毒的生物反应器培养工艺,细胞基质流感病毒灭活疫苗免疫原性和安全性方面均非劣效于鸡胚基质流感疫苗,是未来流感疫苗的发展方向。本研究为细胞基质流感疫苗的研制及生产奠定了基础。     

肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗纯化方法的研究

目的 建立简便、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。方法 采用超滤浓缩、醋酸锌沉淀和柱层析（亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析）等方法，对出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗进行提纯对比试验。结果 用超滤浓缩和Sepharose 4FF凝胶柱层析或用醋酸锌沉淀和凝胶柱层析，纯化的疫苗均可达到质量标准，而用 cellufine sulfate gel亲和层析和离子交换层析均不理想。结论 建立了经济、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。     

肾综合征出血热灭活疫苗毒种的选育及其生物学特性的研究

肾综合征出血热（HFRS）家鼠型病毒株237,经过酶斑选育后,获得的237七毒株,与原来的毒株相比,其生物学特性发生较大的变化,表现在沙鼠肾细胞上增殖的病毒滴度由原来的106.0TCID50／ml增至107.5TCID50／ml;培养液中的抗原量由原来的RPHA1：16增至1：04,由它制成的疫苗免疫家兔的血清,对UR病毒的中和抗体滴度,由原来的≤1:10,增至1：10～≥1:40。表明Z37－5毒株适用于制造灭活疫苗。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。