糖类高渗化合物对TAT穿膜效率的影响

目的研究糖类高渗化合物葡萄糖、蔗糖或甘露醇预处理细胞对TAT穿膜效率的影响。方法人工合成荧光标记多肽TAT-FITC和无意义肽NCO-FITC,将其作用于体外培养的人宫颈癌细胞株Siha、小鼠成纤维细胞L929及人肝癌细胞株HepG2。荧光酶标仪定量检测不同预处理对各细胞摄取荧光标记短肽的影响及内吞抑制药阿米洛利对不同预处理后TAT穿膜的影响;荧光显微镜观察不同预处理后,TAT-FITC的穿膜效率及其在Siha细胞内的定位;MTT检测不同预处理对Siha细胞存活率的影响。结果糖类高渗化合物预处理细胞后,TAT-FITC可高效穿膜进入细胞内,且在胞浆、胞核中均匀分布,胞核浓度高于胞浆浓度;未见NCO-FITC穿膜进入细胞。0.6mol·L-1葡萄糖预处理后,细胞摄取TAT-FITC的荧光强度较0.6mol·L-1蔗糖预处理后相近且较对照组明显增强(P<0.01),0.5mol·L-1甘露醇预处理的荧光强度次之。加入阿米洛利后,糖类高渗化合物预处理的细胞摄取TAT-FITC荧光强度均明显减弱(P<0.01)。MTT数据显示适当浓度的糖类高渗化合物对细胞的活力有轻微影响。结论0.6mol·L-1葡萄糖或0.6mol.L-1蔗糖或0.5mol·L-1甘露醇预处理均可提高TAT对培养细胞的穿膜效率,但对细胞活力影响较小;预处理后细胞可能以内吞方式摄取TAT-FITC短肽。     

人源性双亲性穿膜肽PKV14的合成及其对BHK-21细胞的影响

目的合成人源性双亲性穿膜肽RRTLRRRRAAQRCG(PKV14),并研究其细胞穿膜效果和对细胞活性的影响。方法采用固相合成法合成PKV14,采用高效液相色谱和质谱对PKV14进行验证,使用荧光显微镜和酶标仪观察PKV14在BHK-21细胞系中的穿膜效果,采用MTT实验法检测PKV14的细胞毒性。结果合成了PKV14肽段,并且PKV14对于BHK-21细胞系的穿膜效率极高,细胞毒性实验表明PKV14对BHK-21细胞活性无影响。结论 PKV14是具有高穿膜活性,安全低毒的新型人源性细胞穿膜肽,有作为药物载体的潜力。     

HPV阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽PTP的穿膜特性研究

目的：证实宫颈癌细胞特异性细胞膜穿透肽特异性穿膜并优化穿膜条件。方法：将编码人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌细胞特异性穿膜肽（PTP）的cDNA片断与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因片断融合,克隆至原核表达质粒pET15b克隆位点,构建pET15b-GFP-PTP重组原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达GFP-PTP融合蛋白,纯化后的GFP-PTP融合蛋白作用于体外培养的HPV阳性宫颈癌细胞株HeLa,Siha,肺癌细胞株A549及正常脐静脉内皮细胞ECV304。利用合成的标记短肽探讨优化穿膜条件。结果：荧光显微镜观察发现,与融合蛋白GFP-PTP共孵育后的Hela和Siha细胞胞浆及胞核内有绿色荧光均匀分布,而A549及ECV304胞内无绿色荧光。与GFP共孵育的任何细胞内均无绿色荧光。流式细胞术分析结果显示PTP对HeLa,Siha细胞的穿膜效率分别为33.2％和28.9％。10% DMSO处理细胞后可增强PTP特异性穿透HPV阳性宫颈癌细胞株的胞膜并改善胞浆内分布。结论：本研究结果为进一步探讨PTP作为宫颈癌防治的靶向导入载体奠定了基础。     

细胞穿膜肽在癌症治疗中的应用

细胞膜有选择渗透性,能阻止大多数外来因子进入细胞。然而许多治疗因子必须穿过细胞膜才能进入细胞内起作用。细胞穿膜肽是一组简短的阳离子序列,它具有很强的穿膜能力。自从1988年发现细胞穿膜肽后,细胞穿膜肽被用于携带各种物质,如小分子、核酸、抗体、纳米粒等进入细胞膜。本文重点介绍了近几年来关于细胞穿膜肽穿膜机制的研究进展,以及细胞穿膜肽作为运载体携带抗癌药物靶向进入肿瘤细胞,从而实现对肿瘤细胞的靶向性,同时可克服肿瘤的多药抗药性等研究进展。     

穿膜肽提高纳米银穿膜活性的研究

目的合成纳米银,在其表面修饰穿膜肽(TAT),并检测修饰后纳米银粒对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)的穿膜活性。方法通过化学还原法制备纳米银(AgNP),并通过Ag-S共价键与TAT连接修饰AgNP。通过粒度仪、透射电镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪以及二喹林甲酸法等仪器及方法对其表征、共价连接及TAT的介导活性进行测定。结果成功制备了10 nm以下的AgNP,且修饰TAT后的AgNP(AgNP-TAT)表现出了比AgNP更强的穿膜活性。结论 TAT修饰AgNP后能显著提高其穿膜活性。     

羧甲基壳聚糖对阿霉素所致红细胞膜损伤的保护作用

目的研究羧甲基壳聚糖(CM-COS)对阿霉素所致红细胞膜损伤的影响。方法用阿霉素作用红细胞膜,建立膜损伤实验模型。以红细胞形态学、细胞溶血率、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、细胞膜流动性、封闭能力等为指标,观察羧甲基壳聚糖对红细胞膜损伤的保护作用。结果阿霉素能引起红细胞溶血率和MDA含量增加,SOD活性降低、膜流动性以及膜封闭度下降。而经过一定量的羧甲基壳聚糖(400,600,800μg·mL-1)预处理后红细胞溶血率和MDA含量明显减少,SOD活性、膜流动性和膜封闭度提高。结论羧甲基壳聚糖对阿霉素引发的红细胞膜损伤具有一定的保护作用。     

TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用。结果成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞。对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率。结论TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性。     

穿膜肽的研究进展

穿膜肽是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞,并对宿主细胞没有显著毒副作用.穿膜肽存在多种穿膜机制,诸如直接渗透到细胞膜,通过易位形成的一个暂时性的结构和内吞作用介导入膜等.具体的穿膜机制还不清楚,但普遍认为穿膜肽与细胞表面负电荷物质的直接接触是必不可少的.由于穿膜肽的穿膜性质,其在分子生物学、药学、细胞生物学、疫苗学甚至影像学上有广泛的应用前景.本文对近年来穿膜肽的结构、穿膜机制和应用方面的研究进展进行了综述.     

基于胆固醇上不同连接方式修饰的穿膜肽脂质体的对比研究

目的对比研究胆固醇上以酯键、醚键的不同连接方式修饰穿膜肽TAT(源于Tat蛋白碱性结构域的短肽)脂质体的体内外特性。方法以Rho-PE为荧光标记物,制备在胆固醇上以酯键、醚键的不同连接方式修饰穿膜肽TAT的脂质体,用激发光散射粒度仪测定其粒径;在小鼠血清中考察两种衍生物材料72 h稳定性;以HUVEC、C6、C26细胞为受试细胞,对标记Rho-PE的两种脂质体进行细胞摄取的定量分析;以DID为荧光标记物,以荷瘤小鼠(C26)为受试动物,考察肿瘤部位定量摄取。结果以酯键、醚键不同连接方式的胆固醇上修饰/未修饰有穿膜肽TAT的脂质体的粒径分别为114.50±12.31、113.80±6.74、103.10±1.91、105.10±2.06 nm;多分散系数(PDI)分别为0.227±0.029、0.207±0.039、0.203±0.009、0.216±0.016;小鼠血清中以醚键连接的胆固醇衍生物材料具有良好的稳定性。胆固醇上以不同连接方式修饰的TAT脂质体中,以醚键连接方式制备的脂质体的体外细胞摄取以及体内肿瘤摄取均优于酯键连接方式制备的脂质体。结论醚键修饰的胆固醇衍生物材料所制备的连接TAT的脂质体相较于酯键连接者,有较好的体内外摄取效果。     

穿膜肽与蛋白微球偶联物的制备及鉴定

目的:制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球(BSA-NP)偶联物,并检测其对膀胱癌EJ细胞的穿膜活性.方法:通过异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) 交联的方法制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电镜、荧光显微镜及...     

脂质立方液晶设计制备与表征评价研究进展

目的：研究伊拉地平（ ISR ）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（ MPP＋）损伤的PC12细胞的保护作用及可能机制。方法MPP ＋处理PC12细胞建立帕金森病细胞模型;4-甲基偶氮唑蓝（ MTT）比色法检测细胞存活率;双氯荧光黄乙酸乙酯（ DCFH-DA）染色流式细胞术检测细胞内活性氧（ ROS）的生成;JC-1染色流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（ MMP）。结果1 mmol · L－1MPP＋处理PC12细胞24 h后能明显抑制细胞生长（P＜0．01）;降低线粒体膜电位;ROS含量增加。2μmol· L－1伊拉地平预处理后, PC12细胞存活率显著增加（ P＜0．01）;线粒体膜电位升高;ROS生成减少。结论伊拉地平对MPP＋损伤的PC12细胞具有保护作用,其作用机制可能与维持线粒体正常膜电位,稳定线粒体功能,阻止线粒体氧化应激发生有关。     

GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用

目的研究P53蛋白C端(P53c)对p53基因突变型肿瘤细胞SW480的促凋亡作用。方法用人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(TAT)将P53c运载进入肿瘤细胞,用氧依赖性降解区域(ODD)控制P53c在组织中的稳定性。通过PCR方法制备TAT-ODD-p53c(TOPc),TAT-p53c(TPc)及p53c基因,与pGEX4T载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TAT-ODD-P53c(GST-TOPc),GST-TAT-P53c(GST-TPc)及GST-P53c等融合蛋白。免疫组化方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SW480细胞膜的作用,MTT法检测融合蛋白对SW480细胞活力的影响,流式细胞仪检测致SW480细胞凋亡作用。结果成功构建pGEX系列表达载体,并在大肠杆菌中可溶性表达。Western印迹结果表明,重组蛋白可以和GST单克隆抗体特异性结合。免疫组化显示GST-TPc,GST-TOPcm及GST-TOPc均能进入SW480细胞,GST-TPc能明显降低SW480细胞活性,导致SW480细胞凋亡。含ODD的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用。结论TAT可以介导其融合蛋白跨越细胞膜。GST-TPc可引起p53突变型肿瘤细胞凋亡。     

Molecular mechanisms of adenosine-induced apoptosis in human HepG2 cells

AIM: To investigate effects of adenosine on cell proliferation and apoptosis in human HepG2 cells. METHODS: HepG2 cells were incubated in the presence of adenosine (0.1-5 mmol/L) for 12-48 h, and the effect of adenosine on cell proliferation was evaluated by using 3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay. Hoechst 33342 fluorescent staining, dUTP-fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence and flow cytometric analysis techniques were used to observe cell apoptosis. The effects of adenosine receptor (A1, A2a, A3 and nonspecific receptor) antagonists (8-cpt, DMPX, MRS1191, and theophylline) and an adenosine transporter protein inhibitor (dipyridamole) on adenosine-induced cell apoptosis were observed. Mitochondrial membrane potential was analyzed using DePsipher fluorescent staining, and caspase activity was detected using a Fluorometric assay kit and a fluorescence microplate reader. RESULTS: Adenosine significantly reduced cell viability in a dose- and time-dependent manner. The cytotoxicity of adenosine was related to the induction of cell apoptosis. Four adenosine receptor antagonists had no effect on cell apoptosis. However, dipyridamole significantly reduced the percentage of adenosine-induced apoptotic cells from 27.3% to 7.1% (P<0.05). At 48 h after treatment, 3 mmol/L adenosine increased caspase-3 activity 3.5-fold; dipyridamole markedly decreased caspase-3 activity 1.6-fold, and decreased apoptotic cell numbers. When HepG2 cells were treated with 3 mmol/L adenosine, mitochondrial membrane potential and the activity of caspase-8 or -9 remained unchanged. CONCLUSION: Our results suggest that adenosine-induced apoptosis in HepG2 cells is related to intracellular events rather than cell surface receptors, and that a caspase-3 cascade activation is required, which is not mediated via a mitochondrial pathway.     

二氢石蒜碱对过氧化氢损伤的PC12细胞的保护作用

目的:探讨二氢石蒜碱(DL)对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的影响及其可能机制。方法:用H2O2(200μmol.L-1)处理PC12细胞建立氧化应激模型,并加入二氢石蒜碱预处理作为保护。噻唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞存活率和细胞损伤程度,利用荧光探针DCFH-DA和JC-1分别检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位。结果:H2O2作用于PC12细胞后,细胞存活率下降,LDH活性和ROS含量增高,线粒体膜电位降低,与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.01);10-7～10-5mol.L-1DL预处理后,细胞存活率提高,LDH和ROS变低,线粒体膜电位回升,且在一定范围呈剂量依赖性。结论:DL对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤具有保护作用,其作用机制可能与减少ROS产生和稳定线粒体膜电位有关。     

miR-506 对肝癌细胞恶性表型的影响

摘要:目的 探讨微 RNA-506（microRNA-506,miR-506）对肝癌细胞活性、 增殖和侵袭等恶性表型的调控作 用。方法 以肝癌细胞系 HepG2 和 QGY-7703 为模型, 依处理方式不同分别分为细胞常规培养 （细胞对照） 组、 pcD⁃ NA3 空载体对照组、 转染 pcDNA3/pri-506 过表达 miR-506 （过表达 miR-506） 组、 pSIH1 空载体对照组及转染 pSIH1/ TuD-506 抑制 miR-506 （抑制 miR-506） 组。实时定量逆转录 PCR 检测细胞内 miR-506 的表达水平。分别用 CCK- 8 实验、 体外集落形成实验和 Transwell 侵袭实验检测各组细胞的活性、 集落形成能力和侵袭能力。结果 在肝癌细 胞系 HepG2 和 QGY-7703 中, 与对应的空载体对照组相比, 过表达 miR-506 组的细胞内 miR-506 表达水平升高, 而 抑制 miR-506 组的细胞内 miR-506 表达水平降低（P＜0.05）; 过表达 miR-506 组细胞活性降低且形成集落的数量 和穿过 Transwell 微孔的细胞数量均减少, 而抑制 miR-506 组细胞活性升高且形成集落的数量和穿过 Transwell 微孔 的细胞数量均明显增加（P＜0.05）。与细胞对照组相比, pcDNA3 空载体对照组和 pSIH1 空载体对照组均不影响以 上各指标 （P＞0.05）。结论 miR-506 抑制肝癌细胞的活性、 集落形成能力和侵袭能力等恶性表型, 在肝癌细胞中发 挥抑癌基因的作用。     

珠子参总皂苷对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用

目的:观察珠子参总皂苷对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用,并探讨其作用机制.方法:Wistar乳鼠心肌细胞原代培养,用H2O2建立氧化应激损伤模型,然后用珠子参总皂苷(100,200 μg/mL)孵育24 h后,MTT法检测珠子参总皂苷对细胞活力的影响,流式细胞仪和Hoechst33258染色检测珠子参总皂苷对氧化应激诱导细胞凋亡及胞内ROS含量的影响,比色法测定心肌细胞Caspase-3、Caspase-9的活性,荧光定量PCR测定心肌细胞Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2与Bax的比值.结果:珠子参总皂苷(100,200 μg/mL)能显著改善心肌细胞活性,有效保护线粒体膜电位的稳定,抑制心肌细胞凋亡和改善细胞形态,降低细胞内活性氧(ROS)含量;下调Bax mRNA表达,上调Bcl-2mRNA表达及Bcl-2与Bax的比值;降低H2O2所致新生大鼠心肌细胞中Caspase-3、Caspase-9的活性.结论:珠子参总皂苷对H2O2诱导心肌细胞凋亡有显著的抑制作用,其机制可能与其稳定心肌细胞膜、清除ROS及调节心肌细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3、Caspase 9表达有关.     

In vitro cytotoxic and anti-inflammatory effects of myrrh oil on human gingival fibroblasts and epithelial cells.

Limited scientific studies suggest that myrrh (Commiphora molmol) has antibacterial and anti-inflammatory activities. This study determined myrrh oil (MO) cytotoxicity to human gingival fibroblasts and epithelial cells and its effect, measured by ELISA, on interleukin (IL)-1beta-stimulated IL-6 and IL-8 production. Cell viability and cytotoxicity were determined by metabolic reduction of a tetrazolium salt to a formazan dye (MTT assay) and by release of lactate dehydrogenase (LDH) from membrane damaged (LDH release assay) cells, respectively. Based on the MTT assay, 24- and 48-h exposures to /=0.005%, maximally decreased viability of all cell lines. In the LDH release assay, exposure to /=0.0025% MO caused maximal cytotoxicity; /=0.0025% MO, probably reflective of loss of viability. At subtoxic MO levels (0.00001-0.001%), there was a significant reduction of IL-1beta-stimulated IL-6 and IL-8 production by fibroblasts, but not by epithelial cells.