北美海蓬子胆碱单加氧酶基因CMO的克隆及表达研究

胆碱单加氧酶(CMO)是合成植物小分子非毒性有机渗透调节物质甜菜碱过程中重要的限速酶.文中采用RACE技术以北美海蓬子为实验材料克隆CMO基因的全长c DNA序列(Genbank登录号:KM884944),并做相关的生物信息学分析.研究结果表明,该基因c DNA全长1 834 bp,其中开放阅读框(ORF)有1 317 bp,编码439个氨基酸,预测其蛋白分子量为49.537 k Da,理论等电点(p I)为6.15;序列分析显示北美海蓬子CMO蛋白中含有2个重要的保守域和功能域,不存在跨膜区域;除了与蒺藜苜蓿及水稻的同源性分别为46%和49%外,与其他植物CMO蛋白序列相似性均达到55%以上;系统进化树分析显示,它与欧洲海蓬子的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,随着Na Cl浓度的升高,北美海蓬子CMO基因的表达量增加,说明该基因可通过盐胁迫诱导表达.     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

绿色杜氏藻GGR基因生物信息学分析及表达研究

采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序方法获得绿色杜氏藻GGR基因(GenBank序号: KX100480) cDNA全长序列, 研究了甲基茉莉酸(MeJA)对绿色杜氏藻GGR基因表达的影响. 测序结果表明, 绿色杜氏藻GGR基因cDNA全长2356bp, 开放阅读框1539bp, 编码512个氨基酸, 分子量为52.2961kDa, 理论等电点为6.54. 序列分析结果表明, 该蛋白具有保守的ChlP结构域, 为可溶性蛋白, 具有跨膜区域, 无信号肽. TargetP 1.1 Server预测结果表明, 该蛋白可能定位于线粒体. 系统进化树结果表明, 绿色杜氏藻GGR蛋白较其他植物的GGR蛋白亲缘关系较 远. RT-PCR结果表明, 100?mol·L-1 MeJA可显著地提升绿色杜氏藻GGR基因的表达(P<0.01). 同时, 绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素含量达到最高, 说明GGR基因与绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素的合成存在一定关系     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

呼吸道合胞病毒感染SPC-A1相关新基因zlg10con的电子克隆及分析和验证

通过mRNA差异显示法获得了与呼吸道合胞病毒感染SPC-A1细胞相关的52个表达序列标签(EST)片段，其中的一个EST片段g10-1在RSV感染后的细胞中高表达．采用生物信息学原理和方法对g10-1进行了鉴定后预测这是一个新基因片段，经电子克隆获得了761bp的延伸产物，并且通过了实验验证．该基因片段含有一个典型的54个氨基酸的ORF，命名为zlg10con，并对该序列进行了蛋白结构和功能的分析．     

桔全爪螨几丁质合成酶基因克隆与序列

以桔全爪螨Panonychus citri(MeGregor)为研究对象,利用RT-PCR和SMART RACE技术克隆获得其几丁质合成酶基因的全长cDNA序列(命名为PcCHS,GenBank登录号为KM242063),并利用生物信息学方法对序列进行分析。结果表明:桔全爪螨几丁质合成酶PcCHS基因的cDNA全长为4 925bp,其中5’非翻译区(5’-UTR)为155bp,3’非翻译区(3’-UTR)为345bp,开放阅读框(ORF)包含4 425bp,编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.43kD,理论等电点为6.83。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。ExPASy在线分析表明,PcCHS具有15个跨膜螺旋、4个糖基化位点。推导的氨基酸序列同源性分析结果表明:桔全爪螨与二斑叶螨相似度为89%,其次为西方盲走螨,相似度为55%。分子系统进化的结果也表明桔全爪螨与二斑叶螨和西方盲走螨的进化关系最近。     

乌龟线粒体细胞色素b基因片段的初步研究

于2004年3月从浙江省级中华草龟良种场采集5只乌龟（Chinemys reevesii）．参照鱼类的线粒体细胞色素b基因序列设计合成1对引物，扩增了乌龟的细胞色素b基因片段，并对扩增产物进行序列测定分析．结果在5个个体中都获得序列相同的细胞色素b基因片段，长度为408bp，其中A、T、G、C含量分别为125bp（30．6％）、113bp（27、7％）、51bp（12．5％）、119bp（29．2％），与其他水生动物相同基因片段碱基序列含量相似．     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．     

少棘蜈蚣毒素多肽SsmTx1全长cDNA的克隆和序列分析

构建了少棘蜈蚣毒腺组织cDNA文库.运用PCR方法从少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)毒腺组织cDNA文库中筛选到一个全新的毒素多肽cDNA序列,命名为SsmTx1.SsmTx1全长为417 nt,3′和5′非编码区(UTR)分别为120 nt和54 nt,其加尾信号aataaa在距离poly(A)上游16 nt.SsmTx1序列含有一个240nt的开放阅读框(ORF),共编码80个氨基酸残基,其中包括25个氨基酸的信号肽序列和55个氨基酸的成熟毒素多肽序列,含有2对二硫键.SsmTx1毒素基因是从少棘蜈蚣毒中分离鉴定的全长毒素多肽.     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种群COI和ITS1基因序列特征及遗传多样性分析

为了解象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种质资源的遗传多样性现状, 采用COI和ITS1分子标记对该种群进行了基因序列特征和遗传多样性分析. 结果表明 在该种群30个个体中扩增得到的COI基因序列长度均为709bp, ITS1序列长度范围在693~729bp(共有746个位点). COI基因序列的位点中有670个保守位点(占94.50%)、39个变异位点(占5.50%); ITS1序列的位点中有保守位点671个(占89.95%)、变异位点62个(占8.31%)和缺失/插入位点13个(占1.74%). COI基因序列的保守性高于ITS1序列. 在COI基因序列中碱基(A+T)的占比(65.84%)高于(C+G), 而ITS1序列中则是碱基(A+T)占比(37.59%)低于(C+G). COI和ITS1序列的遗传距离分析均显示群体内遗传分化不明显. 基于COI基因序列和ITS1序列构建的遗传进化树显示 各科贝类分别相聚, 象山港菲律宾蛤仔位于帘蛤科的分支中, 其COI序列与杂色蛤进化关系最近. 遗传进化树中各种贝类的聚类关系与传统分类学结果相一致, 可作为分类的参考. COI和ITS1序列的平均核苷酸差异数分别为5.497和6.549, 核苷酸多样性指数分别为0.00775和0.00973, 单倍型数目分别为21和28, 单倍型多样性分别为0.963和0.993, 根据COI和ITS1两个序列计算得到的菲律宾蛤仔象山港群体单倍型多样性均大于0.5, 核苷酸多样性指数均大于0.005, 表明该种群遗传多样性丰富, 并处于稳定状态. 本研究结果补充了菲律宾蛤仔遗传多样性方面的研究资料, 并可为象山港菲律宾蛤仔种质资源保护和遗传育种提供理论基础.     

人胎盘间充质样干细胞的分离、培养及其生物学特性分析

从组织块中分离纯化成体干细胞具有一定的困难,其他细胞的混杂成为获取高纯度组织干细胞的一个技术瓶颈.以人体胎盘为研究对象,在分散组织细胞的基础上,通过不同时间梯度贴壁方法分离纯化了人胎盘间充质样干细胞,并与常规的直接贴壁方法作了比较,同时分析了时间梯度贴壁方法分选细胞的增殖能力、多分化潜能以及免疫原性.研究结果表明,时间梯度贴壁法获得的细胞具有较强的增殖能力.直接贴壁法得到的细胞不具有分化潜能,而时间梯度贴壁法获得的细胞具有向成骨细胞和成脂肪细胞方向分化的能力.通过对免疫原性基因检测的分析,表明时间梯度贴壁法获得的细胞表达HLA-Ⅰ,但不表达HLA-Ⅱ.     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

Quox-1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的 Ｑｕｏｘ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的ｃ３ 片段为探针,与豚鼠基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交,结果表明,在豚鼠基因组中存在 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列以抗 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸、附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析,发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白表达,提示 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用     

MYC基因在人类HL－60和CEM癌细胞系中原位表达的研究

以细胞分子原位杂交方法对两种不同类型的人类白血细胞系ＨＬ－６０和ＣＥＭ，以及正常人白细胞中Ｃ－ｍｙｃ基因的表达进行了比较研究．结果证明：ＨＬ－６０细胞中Ｃ－ｍｙｃ基因有异常高水平的表达，而在ＣＥＭ细胞和正常人白血球与淋巴细胞中则没有明显的Ｃ－ｍｙｃ转录产物．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析表明，ＨＬ－６０细胞基因组中Ｃ－ｍｙｃ基因有显著的扩增现象；而ＣＥＭ细胞基因组中的Ｃ－ｍｙｃ基因的拷贝数与正常人血细胞的接近，属正常水平表达。再次证明了ＨＬ－６０细胞系Ｃ－ｍｙｃ基因的异常高水平表达，与该基因的大量扩增紧密相关．还对两种癌细胞系的癌变机理和细胞原位杂交在基因表达研究中的应用进行了讨论．