大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪☆

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。 目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。 方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。 结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。      

间充质干细胞标记示踪方法研究进展

间充质干细胞（MSCs）具有很强的自我更新能力和多向分化潜能,现已成为组织修复的理想种子细胞和基因治疗的靶细胞。但MSCs移植入体内的标记和示踪是当今研究的热点和难点问题。目前常用的标记示踪技术按不同的标记分类有：荧光染料标记,分子细胞标记,影像学成像技术标记等。就这些标记示踪方法的优缺点加以综述。     

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植可行性研究

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性。方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉，2周后取心脏建立Langerndorff模型。将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部，同时收集右心房回流的液体，离心后通过流式细胞仪计数细胞数量。观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例。并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率，评价其安全性。在体实验中取心梗后2周的大鼠，经左心室--主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部，分别在移植后1及24h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况。结果 离体实验发现经冠状动脉内注射髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留，移植后对LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化。在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内，在心内膜下组织内较少细胞分布，而且大部分细胞在正常心肌组织内，只有少量在心梗区域。而在细胞移植后1~ 4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内，在正常组织内很少有移植细胞存在。结论 经冠状动脉内途径进行细胞移植是安全可行的。     

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植的可行性

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性.方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉,2周后取心脏建立Langerndorff模型.将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部,同时收集右心房回流的液体,离心后通过流式细胞仪计数细胞数量.观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例.并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率,评价其安全性.在体实验中取心梗后2周的大鼠,经左心室-主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部,分别在移植后1及24 h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况.结果 离体实验发现经冠状动脉内注射骨髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留,移植后LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化.在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内,在心内膜下组织内较少细胞分布,而且大部分细胞在正常心肌组织内,只有少量在心梗区域.而在细胞移植后1～4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内,在正常组织内很少有移植细胞存在.结论 经冠状动脉途径进行细胞移植是安全可行的.     

骨髓腔内输注脐带血及间充质干细胞对大鼠免疫重建影响

目的探讨骨髓腔内（IBM）输注脐带血及骨髓间充质干细胞（BMSC）对移植后大鼠免疫重建的影响。方法雌性F344胎鼠及新生鼠外周血（FNPB）及雄性F344大鼠BMSC共移植经致死量60Coγ射线辐照的雌性Wistar大鼠,其中FNPB均由IBM输注,BMSC则通过IBM或尾静脉（IV）注射。观察受鼠存活状况、供体造血干细胞（HSC）植入水平、免疫细胞及功能恢复、移植物抗宿主病（GVHD）表现,并用PCR检测受鼠供体BMSC来源Y染色体。结果两共移植组60d均100%存活,生存率和供体HSC植入水平差异无统计学意义,但明显优于单纯FNPB移植组;骨髓腔共移植组外周血白细胞及粒单系细胞集落形成单位（CFU-GM）、混合集落形成单位（CFU-GEMM）集落产率恢复较快,14d显著高于其他组（P〈0.05）。而单纯FNPB移植组各检测时点集落计数均明显低于共移植组（P〈0.05）,30dCD19＋细胞比例亦明显低于正常;30d各移植组PHA、LPS诱导淋巴细胞增殖实验及单向混合淋巴细胞培养无明显差异;60d两共移植组存活受鼠均检测到供体BMSC来源Y染色体。结论 HSC与BMSC联合输注可促进受者免疫重建,尤以IBM输注为佳。     

成年大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离

目的应用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法以不同培养条件,探讨体外获得高质量、高活性的成年大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法。方法取成年雄性SD大鼠双侧股骨,应用全骨髓贴壁法,分为10%国产TBD胎牛血清+DMEM组、10%国产TBD胎牛血清+DMEM/F12组、12.5%国产TBD胎牛血清+DMEM/F12组、10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12组4组,3只/组;应用密度梯度离心培养法,以10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12作为培养基,取3只大鼠作为一组。比较不同培养方法及培养条件对BMSCs生长增殖的影响。结果全骨髓贴壁法中10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12组原代细胞即可7～9 d达融合,传代到第4代细胞活力仍很好。其余3组原代细胞达融合的时间均超过10 d,且传代后细胞活力差,容易出现老化。密度梯度离心培养法原代贴壁细胞太少,无法达融合。结论本实验采用的培养方法中,10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12培养基的全骨髓贴壁分离法,是体外获取成年大鼠BMSCs最佳方法。     

绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪分化能力初探

探讨绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪分化能力的变化.选用3月龄健康SD雌性大鼠行双侧卵巢切除术后,建立骨质疏松症的动物模型,使用密度梯度离心法分别获取各组的骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传至3、4代后,加入成脂肪诱导液进行成脂肪诱导后,观察细胞形态改变,并用RT-PCR法检测成脂肪分化过程的标志物脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平.实验分为3月正常未诱导组(3conMSCs)、3月骨质疏松未诱导组(3ovx MSCs)、3月正常成脂肪细胞诱导组(3conADI)、3月骨质疏松成脂肪细胞诱导组(3ovxADI).结果显示(1)形态学改变,成脂肪诱导后,MSCs成类圆形,在胞浆内有脂滴形成,3ovxADI组形成脂滴明显多于3conADI组.(2)LPL的mRNA的表达,未诱导组3conMSCs组和3ovx MSCs组没有表达;诱导组在诱导7 d时,有表达,而且3ovxADI组明显高于3conADI组;诱导14 d时,趋势一致,诱导组的表达量均高于7 d.通过检测成脂肪分化的指标LPL的mRNA的表达发现,3ovx组明显高于3con组.研究结果表明,绝经后骨质疏松症大鼠MSCs成脂肪分化能力增强.     

提取人骨髓间充质干细胞的新方法与传统方法比较

背景:提取人骨髓间充质干细胞主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选及免疫磁珠分选等方法。流式分选及磁珠分选等方法对设备及试剂要求高,应用局限。全骨髓贴壁培养法及密度梯度离心法较为常用,但仍有全骨髓贴壁法细胞长出速度较慢、密度梯度离心法所需离心时间较长等不足。若发现一种更简便、且能够短时间提取骨髓间充质干细胞的方法则可进一步提高实验效率。目的:介绍一种新的提取人骨髓间充质干细胞的方法,并与传统方法进行比较,证明新方法的可行性及实用性。方法:将磷酸缓冲盐溶液与人骨髓组织等比例混匀后离心使骨髓组织分层,取白膜层提取人骨髓间充质干细胞,与全骨髓贴壁法提取的人骨髓间充质干细胞进行对比。采用流式细胞分析及诱导多向分化实验进行鉴定。通过细胞计数、结晶紫染色、细胞骨架染色、划痕实验、Transwell迁移实验、RT-PCR等方法,分析两组细胞的原代细胞数目、传代后细胞形态、大小、细胞骨架、表面标志物表达、多向分化潜能、集落形成、增殖、迁移及成骨分化能力。结果与结论:(1)离心后磷酸缓冲盐溶液能够使人骨髓分层,并能够提取出人骨髓间充质干细胞;磷酸缓冲盐溶液法所提取的原代细胞数目较全骨髓贴...     

骨髓和脂肪来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较

目的比较脂肪源间充质干细胞(AMSCs)和骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)的免疫调节能力的差异。方法用流式细胞仪分析AMSCs和BMSCs的表型。通过MSCs和淋巴细胞共培养体系,检测MSCs对T细胞增殖、周期、活化、凋亡以及Th细胞分化的影响。结果表型分析结果显示AMSCs和BMSCs的表型基本一致。AMSCs和BMSCs都能抑制T细胞的增殖和早期活化,并在调节辅助性T细胞亚群的分化上作用类似。但在MSC对活化后T细胞的凋亡影响方面,BMSCs能够抑制活化T细胞的凋亡,而AMSC没有这种作用。结论 AMSCs和BMSCs对T淋巴细胞的影响基本类似,其对活化T细胞凋亡影响的差异还有待进一步的机制研究。     

骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损

背景：对于高原地区受到环境负面影响的组织创伤,例如高原骨缺损,干细胞的特点可以提供一个良好的加速创伤修复的方法。 目的：研究骨髓间充质干细胞治疗大鼠高原股骨缺损的创伤恢复效果。 方法：分离提取雄性Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞,取第3代细胞进行细胞表型鉴定。雌性Wistar大鼠80只,制备实验性股骨圆形缺损后随机均分为平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组、高原对照组、高原骨髓间充质干细胞移植组(n=20)。治疗后第30天拍X射线片观察股骨缺损区的修复情况,并于第10,20,30天分别采集股骨缺损区组织,检测其中碱性磷酸酶的含量。 结果与结论：高原骨髓间充质干细胞移植组大鼠股骨缺损区愈合速度较高原对照组快,且碱性磷酸酶的含量较高原对照组高(P < 0.05);平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度也比平原对照组快,且碱性磷酸酶的含量也较平原对照组高(P < 0.05)。平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度较高原骨髓间充质干细胞移植组快,且碱性磷酸酶的含量较高原骨髓间充质干细胞移植组高(P < 0.05)。说明骨髓间充质干细胞的局部移植可提高高原股骨缺损区局部的碱性磷酸酶含量,加速缺损区的创伤修复速度,但高原股骨缺损区的愈合修复较平原组慢。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、胰岛素等诱导MSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。结果诱导培养4d后,细胞胞浆内开始出现细小脂滴,12 d后在可观察到大量细胞由长梭形变为圆形或多边形,胞浆内形成高折光性的脂滴,苏丹Ⅳ脂肪染色后显示克隆中心的细胞胞浆内大量的颗粒状红色脂滴形成。细胞爬片显示约有60%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。结论大鼠骨髓间充质干细胞能进行体外分离培养并能诱导分化为脂肪细胞。     

婴幼儿骨髓间充质干细胞体外培养及基本生物学特性的实验研究

目的 建立一种体外分离和培养婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的方法，并探讨其基本生物学特性。方法 麻醉、无菌条件下行胸骨穿刺抽取先天性心脏病婴幼儿骨髓3mL-5mL，经密度梯度离心获得单个核细胞（Percoll分离液，γ为1．073），接种入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，测定其生长曲线，流式细胞仪检测婴幼儿BMSCs表面标记，并观察其形态、贴壁率、集落形成能力和超微结构的变化。结果 培养的要幼儿BMSCs 3h-4h后开始贴壁，贴壁率为65％-80％；2d-3d可见集落形成；10d左右汇合90％以上。BMSCs随着传代次数增加集落形成率逐渐降低。培养期间细胞形态均一，基本上为梭形成纤维细胞样形态。婴幼儿BMSCs表面标记CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。透射电镜观察，婴幼儿BMSCs具有BMSCs典型的超微结构。结论 成功地建立了一种体外分离培养先天性心脏病婴幼儿BMSCs的方法，获得的细胞形态均一，生长稳定，增殖较快，能为体外构建组织工程化先天性心脏病修复材料提供重要的种子细胞的来源。     

脑内移植间充质干细胞治疗大鼠帕金森病模型的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)脑内移植治疗帕金森病(PD)大鼠的可行性。方法贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓MSCs。将BrdU标记的第3代MSCs移植到PD大鼠纹状体内,移植后1、2和4周检测PD大鼠的行为学变化,应用BrdU免疫荧光观察移植细胞在脑内的存活情况,应用免疫组化法检测酪氨酸羟化酶(TH)在移植细胞及黑质的表达。结果移植细胞后1周、2周和4周PD大鼠与移植前相比行为学有改善,旋转圈数明显减少(P<0.05);PD大鼠损毁侧和健侧黑质内TH阳性细胞数之比随移植时间的延长而增加,但未发现移植细胞呈现TH阳性表达。细胞移植后1周、2周和4周检测均可见纹状体内BrdU阳性细胞散在分布。结论植入脑内的MSCs能够生存和迁移,MSCs脑内移植对PD大鼠有一定的治疗作用。     

机械拉伸刺激对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的调节

目的　以大鼠骨髓间充质干细胞(rat marrow mesenchymal stem cells, rMSCs)为实验对象，考察拉伸的加载对体外的调节作用。方法　采用密度梯度离心法分离培养rMSCs，免疫细胞化学染色观察细胞表面相关抗原的表达，流式细胞技术分析细胞周期分布。采用拉伸加载实验装置对培养细胞进行不同应变大小和作用时间的拉伸加载，MTT分析rMSCs的增殖，RT-PCR技术检测c-fos基因表达变化。结果　Percoll密度梯度离心结合差异贴壁法能有效分离rMSCs，在含15%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长，呈长梭形或纺锤形。rMSCs均一表达CD44和Fibronectin，不表达CD34，G0/G1期细胞占90%以上。拉伸刺激后rMSCs的OD值增加，在研究的时间(15~60 min)和应变范围(2%~8%)内表现出时间和应变依赖特征。RT-PCR结果表明rMSCs在1.0Hz、8%应变条件下拉伸60 min后，c-fos基因表达明显增加。结论　研究提示，rMSCs的体外生长受机械拉伸作用的调节；适宜的拉伸刺激可明显促进体外培养rMSCs的增殖。     

Dysfunctional Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Patients with Poor Graft Function after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation

Poor graft function (PGF) is a life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) and is characterized by defective hematopoiesis. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been shown to support hematopoiesis, but little is known about the role of MSCs in the pathogenesis of PGF. In the current prospective case-control study, we evaluated whether the number and function of bone marrow (BM) MSCs in PGF patients differed from those in good graft function (GGF) patients. We found that BM MSCs from PGF patients expanded more slowly and appeared flattened and larger, exhibiting more apoptosis and senescence than MSCs from GGF patients. Furthermore, increased intracellular reactive oxygen species, p-p53, and p21 (but not p38) levels were detected in MSCs from PGF patients. Moreover, the ability of MSCs to sustain hematopoiesis was significantly reduced in PGF patients, as evaluated by cell number, apoptosis, and the colony-forming unit–plating efficiency of CD34⁺ cells. In summary, the biologic characteristics of PGF MSCs are different from those of GGF MSCs, and the in vitro hematopoiesis-supporting ability of PGF MSCs is significantly lower. Although requiring further validation, our study indicates that reduced and dysfunctional BM MSCs may contribute to deficient hematopoiesis in PGF patients. Therefore, improvement of BM MSCs may represent a promising therapeutic approach for PGF patients after allo-HSCT.     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。     

A Biological Pacemaker Restored by Autologous Transplantation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Objective：To restore cardiac autonomic pace function by autologous trans- plantation and committed differentiation of hone marrow mesenchymal stern cells, and explore the technique for the treatment of sick sinus syndrome. Methods ： Mesenchymal stern cells isolated from canine bone marrow were culture-expanded and differentiated in vitro by 5-azacytidine. The models of sick sinus syndrome in canines were established by ablating sinus node with radio-frequency technique. Differentiated mesenchymal stem cells labeled by BrdU were autologously transplanted into sinus node area through direct injection. The effects of autologous transplantation of mesenchymal stern cells on cardiac autonomic pace function in sick sinus syndrome models were evaluated by electrocardiography, pathologic and immunohistochemical staining technique. Results：There was distinct improvement on pace function of sick sinus syndrome animal models while differentiated mesenchymal stem cells were auto-transplanted into sinus node area. Mesenchymal stern cells transplanted in sinus node area were differentiated into similar sinus node cells and endothelial cells in vivo, and established gap junction with native cardiomyocytes. Conclusion ： The committed- induced mesenchymal stern cells transplanted into sinus node area can differentiate into a- nalogous sinus node cells and improve pace function in canine sick sinus syndrome models.     

蚕丝丝素纤维的制备及其与骨髓间充质干细胞相容性的研究

组织工程为韧带损伤修复提供了可行途径，但韧带修复对支架材料各方面性能要求都很高。在力学性能方面，不仅要求材料有一定的强度而且需要有良好的韧性。在满足力学性能的同时，支架材料还必须兼具优良的生物相容性。蚕丝作为一种天然生物蛋白质，由于其良好的力学性能显示了在组织工程方面应用的前景。但由于丝胶存在污染问题，因此脱胶成为蚕丝在医学领域应用的首要问题。本实验首先比较了三种脱胶试剂对蚕丝力学性质的影响，选择了影响最小的碳酸钠作为脱胶试剂，进而确定了碳酸钠脱胶的最佳条件为：试剂浓度0．40%，温度90℃，时间为1h。然后在脱胶后的丝紊纤维上种植了大鼠骨髓问充质干细胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells，rMSCs），通过扫描电镜（SEM）、荧光显微镜检测了丝素上细胞的生长情况，结果显示蚕丝具有良好的生物相容性，细胞亲和力。为蚕丝在韧带组织工程方面的进一步应用奠定了基础。     

Mesenchymal Bone Marrow Stem Cells More Effectively Stimulate Regeneration of Deep Burn Wounds than Embryonic Fibroblasts

Regeneration of deep burn wounds after transplantation of allogenic and autogenic fibroblast-like bone marrow mesenchymal stem cells and embryonic fibroblasts on burn surface was studied in 40 Wistar rats. Transplantation of allogenic and autogenic fibroblast-like bone marrow mesenchymal stem cells and transplantation of embryonic fibroblasts decreased cell infiltration of the wound and accelerated the formation of new vessels and granulation tissue in the wound in comparison with the control (burn wounds without cell transplantation). Regeneration processes were most active after transplantation of fibroblast-like bone marrow mesenchymal stem cells, in particular, autogenic cells, which was confirmed by more rapid decrease in burn surface area. Wound healing after transplantation of fibroblast-like bone marrow mesenchymal cells and embryonic fibroblasts was associated with long functioning of transplanted cells (as was shown by staining for -galactosidase, the cells were transfected with an adenovirus vector carrying the marker gene). It is hypothesized that more rapid regeneration of burn wounds after transplantation of fibroblast-like bone marrow mesenchymal stem cells was due to low differentiation of these cells in comparison with embryonic fibroblasts.     

猪骨髓间质干细胞分离培养及表面抗原鉴定

目的 建立猪骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC）体外分离培养、纯化的方法,观察其生物学特性,为其作为组织工程学种子细胞提供实验基础.方法 取猪的胸骨骨髓6～8ml,用Ficoll淋巴细胞分离液提取单核细胞,采用贴壁法培养.接种后2h利用倒置显微镜观察细胞的大体形态,并利用流式细胞仪检测细胞抗原表达.结果 原代培养接种3～4h后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3～4d后细胞呈纺锤形且形成为单个或数个细胞克隆,7～9d后集落迅速增多,细胞融合,在10～12d细胞铺满全层.流式细胞仪监测到BMMSC表达CD29、CD44、CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD11a、CD14、CD31、CD34、CD45.结论 采用密度梯度离心法培养猪的BMMSC生长稳定,增殖能力强,具有间质干细胞的表面抗原特征,该方法可作为培养猪BMMSC的常规方法.