体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

EGF和HGF体外诱导肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）诱导肝硬化患者骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝细胞分化的可行性。方法取肝硬化志愿者骨髓，密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取MSCs，分别用含有HGF、EGF、HGF＋EGF或不加生长因子的培养基进行培养。用流式细胞仪、免疫细胞化学法鉴定细胞表型，酶联免疫吸附法检测培养上清液中Alb水平。结果肝硬化患者骨髓MSCs生长良好，表型为CD29阳性，CD34阴性。诱导组细胞可在21～28d时，形态变为三角形、多角型或类圆形。诱导组细胞7d检测到AFP的表达，21、28d检测出CK18阳性，并以时间依赖方式产生Alb。未诱导组在以上时间点未检测到上述指标。结论HGF、EGF均能诱导骨髓MSCs分化为肝样细胞，两者在一定程度上具有联合作用。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的 观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞，利用Percoll法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞，应用肝细胞生长因子(HGF)20mg／ml表皮生长因子(EGF)1．5μg／ml联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的mRNA的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形，两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达，RT-PCR检测有白蛋白的mRNA的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

大鼠骨髓源性肝干细胞形态学特征的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓源性肝干细胞的形态特性和来源。方法：HGF体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝样细胞分化,诱导第0、7、14、21天,相差显微镜观察细胞形态特征,电镜观察第21天诱导组与非诱导组细胞超微结构变化;免疫细胞化学法检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角质蛋白18（CK18）的表达;PAS检测细胞糖原。结果：HE染色较深的小圆形细胞在非诱导条件下各时相直径未发生明显变化,AFP、CK18、糖原染色均为阴性;诱导组HE染色较深的小圆形细胞与AFP、CK18、糖原染色阳性的细胞形态大小一致,随诱导时间延长其直径增大。透射显微镜观察：第21天诱导组细胞间有大量的微绒毛,细胞内可见到丰富的粗面内质网、线粒体、溶酶体、吞饮泡;第21天非诱导组细胞间仅有少量微绒毛,细胞质较少。结论：骨髓源性肝干细胞很可能来源于集落中HE染色较深的小圆形细胞,在HGF诱导下可以分化为肝样细胞,其形态学及超微结构与肝细胞结构相符合。     

肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力

目的：利用肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝细胞分化,为肝组织工程提供新的细胞来源。方法：取志愿者骨髓,使用密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取MSCs,用含有HGF、EGF、FGF的培养基进行培养。用流式细胞仪、免疫细胞化学法鉴定细胞表型,检测诱导后细胞胆红素处理能力。结果：骨髓MSCs生长良好,表型为CD29阳性,CD34阴性。诱导后细胞可在21～28 d时形成肝样细胞。诱导7 d后细胞检测到AFP的表达,第14天时CK18呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率增加,并能显著降低胆红素浓度。结论：HGF、EGF、FGF联合能诱导骨髓MSCs分化为具有处理胆红素能力的肝样细胞。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中α－玉米赤霉醇对 PⅠNP 和 BMP －2表达的影响

目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中α－玉米赤霉醇（α－ZAL ）对Ⅰ型前胶原 N 端前肽（PⅠNP）和骨形态发生蛋白－2（BMP －2）表达的影响。方法采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞分为空白诱导组、阳性诱导组及高、中、低浓度α－ZAL 诱导组。空白诱导组仅加入成骨条件培养基，阳性诱导组加入等量成骨条件培养基及雌二醇，高、中、低浓度α－ZAL 诱导组分别加入成骨条件培养基及梯度浓度（10－5、10－6、10－7 mol ／L）的α－ZAL。采用 ELISΑ法测定 PⅠNP 和 BMP －2的表达量。结果小鼠骨髓间充质干细胞原代培养呈长梭形，有接触抑制现象，诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状，细胞生长密集时可重叠生长。与空白诱导组比较，各组 PⅠNP 表达量均明显升高（P ＜0．01），阳性诱导组及低、中浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量均明显升高（P ＜0．01），高浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量明显下降（P ＜0．01）。与阳性诱导组比较，低浓度α－ZAL 诱导组 PⅠNP 表达量明显升高（P ＜0．01），而中、高浓度α－ZAL诱导组 PⅠNP 表达量明显下降（P ＜0．01），低、中浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量均明显升高（P ＜0．01），高浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量明显下降（P ＜0．01）。结论α－ZAL 呈剂量相关性促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，低浓度（10－7 mol ／L）α－ZAL 可显著促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中 PⅠNP 和BMP －2的表达，随着剂量的升高，促进作用下降。     

调肝益气通络方药物血清诱导骨髓间充质干细胞转化为肝细胞的研究

目的探讨调肝益气通络方诱导大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem cells,MSC）向肝细胞定向分化的能力。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSC,制备肝纤维化大鼠模型,灌胃调肝益气通络方后提取药物血清,用含药血清,对照肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）诱导MSC向肝细胞的分化若干天后;进行相关指标检测。结果1．各浓度含药血清在加入1、7、14d后,其细胞数量均显著多于常规培养组。2．含药血清诱导MSC分化7d后,高剂量组甲胎蛋白（Alpha Fetopmtein,AFP）与白蛋白（Albumin,ALB）的阳性细胞率均显著高于HGF组,角蛋白18（Cy—tokeratin 18,CK18）的阳性细胞率与HGF组差异无统计学意义。诱导MSC分化14d后,高剂量组AFP、ALB、CK18的阳性细胞率显著高于HGF组。结论调肝益气通络方具有诱导MSC分化为肝细胞的能力。     

Notch-1蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的表达

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、成纤维生长因子-4（fibroblastg rowth factor-4,FGF-4）和间接共培养条件下诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化可行性及Notch信号系统在此分化过程中作用。方法分别采用含有HGF、FGF-4条件诱导液单独培养骨髓间充质干细胞（bone mesenchymM stem cell,BMSC）以及Transwell培养板联合培养MSC和肝细胞,同时加入Notch-1蛋白抑制剂DAPT,通过免疫细胞化学检测白蛋白和Notch-1蛋白表达,RT．PCR检测Notch-1mRNA表达。结果条件诱导液培养第9天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch-1mRNA表达降低;联合培养组第3天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch．1mRNA表达降低。加入DAPT抑制Notch信号系统,提高诱导分化率。结论在一定诱导因素作用下,骨髓间充质干细胞可以向肝细胞转化,而且转化的肝细胞具有合成白蛋白功能。在此转化过程中Notch信号系统起到关键作用。     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

小鼠骨髓源性干细胞迁移到缺血再灌注损伤肾脏内表达CK18和RCA的观察

目的观察小鼠骨髓源性干细胞(bone marrow derived stem cells,BMSCs)在缺血再灌注(I/R)损伤肾脏内表达细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)和蓖麻凝集素(Ricinus communis,RCA)的情况.方法制备BALB/c雌鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,亚致死剂量60Co照射后通过尾静脉移植同系雄鼠骨髓细胞,于移植后不同时相点采用PCR检测受体鼠骨髓中Sry基因表达,免疫组化染色结合Y染色体荧光原位杂交(Y-FISH)观察受体肾脏中骨髓源性干细胞的分化情况.结果骨髓移植15 d后,PCR检测到受体鼠骨髓中有Sry基因表达;骨髓移植30 d后,连续切片免疫组化染色结合Y-FISH观察到受体鼠肾脏中存在Y /CK18 和Y /RCA 细胞.结论静脉移植的骨髓源性干细胞可迁移到I/R损伤肾脏,并在局部微环境诱导下表达肾小管上皮细胞的表型特征CK18和RCA.     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

骨形态发生蛋白激活自身肌肉间质细胞拯救骨髓衰竭

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)激活自身肌肉间质细胞以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法采用5-氟脲嘧啶与白消安合用诱导大鼠致死性再生障碍性贫血模型,于诱导再障前3d肌肉内植入重组人-BMP-2(rh-BMP-2),并以肌肉内植入琼脂为对照。观察血象、病理形态等变化以及两组再障大鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-2,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,随后形成骨及骨髓,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障大鼠,不仅血象与对照相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有56.3%大鼠存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照大鼠除1只存活超过3个月外(占4.3%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论BMP肌肉内植入可拯救骨髓造血衰竭,其机制可能与BMP诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关;本研究结果为应用成体自身干细胞进行细胞治疗提供了新的途径。     

骨形态发生蛋白诱导髓外造血的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)诱导髓外造血以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法:采用60Co-γ+氯霉素(CH)+环磷酰胺(CY)的方法诱导小鼠致死性再生障碍性贫血模型,实验组于诱导再障前6d肌肉内植入重组人-BMP-4(rh-BMP-4),对照组小鼠肌肉内植入琼脂。观察血象、病理形态等变化以及两组再障小鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-4,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位(CFU-S)以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果:正常小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,2周后才出现软骨化骨和骨小结形成,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障小鼠,不仅血象与对照组相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有46.7%存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照小鼠除1只存活超过3个月外(占6.7%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论:肌肉内植入BMP-4可诱导髓外造血,其机制可能与BMP-4诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关,这一结果将为干细胞治疗提供了一条新的思路。     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的探索应用Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的效果,筛选出所涉及的信号通路,并验证Hippo 信号通路。方法对大鼠股骨骨髓间充质干细胞进行提取、分离、传代培养及鉴定。取第3代细胞进行诱导培养,分为SD大鼠 BMSCs（A组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3（B组）、SD大鼠BMSCs+20 ng/mL HGF（C组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF（D组）和大鼠肝细胞（E组）。分别在诱导后7、14、21、28 d进行细胞形态学观察、糖原染色观察,并行实时 定量PCR 以及Western blot 检测,鉴定其分化情况。取B组细胞行基因芯片检测。将BMSCs 与Gal-3、Gal-3+XMU-MP-1 （Hippo信号通路抑制剂）分组进行诱导,Western Blot检测YAP、P-YAP、ALB、AFP、CK-18。结果大鼠股骨骨髓分离出的细胞 符合骨髓间充质干细胞特性。诱导后,B、C、D组BMSCs形态逐渐向肝样细胞转化,D组28 d时细胞形态与肝细胞相对比相似 度最高。糖原染色28 d 时A组无染色,B、C、D组染色较前增多,B、C组间无明显差异（P>0.05）,D组染色率最高（P<0.05）。 Q-PCR检测AFP、ALB、CK-18表达逐渐升高,28 d时B组与C组各指标较接近（P<0.05）。Gal-3与HGF对AFP、ALB的mRNA 表达不存在交互效应（AFP：F=0.236, P=0.640;ALB：F=50.639, P=0.000）,对CK-18 的mRNA表达有协同效应（F=50.639, P= 0.000）。Western blot检测A组几乎不表达AFP、ALB及CK18,B、C、D组AFP、ALB及CK18蛋白表达随时间延长,逐渐增加。 基因芯片检测发现上调基因27个,下调基因62个。涉及TGF-β、PI3K-Akt及Hippo等信号通路。Gal-3及Gal-3+XMU-MP-1诱 导组的YAP表达较空白对照组增加,Gal-3+XMU-MP-1较单独应用Gal-3诱导BMSCs分化的效率高。结论Galectin-3能够单 独诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,而且联合HGF诱导BMSCs分化的效率更高。诱导过程与TGF-β、PI3K-Akt 及 Hippo等信号通路相关。抑制Hippo信号通路可提高诱导效率。     

异体骨髓间充质干细胞在骨髓嵌合小鼠体内分化为肝细胞的实验研究

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性.方法 雌性C57BL/6J小鼠全身一次性接受10Gy 60Coγ射线照射后立即接受同品系绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植.移植后1周、1、3个月取骨髓嵌合小鼠肝脏,石蜡切片行GFP抗体免疫组化,冰冻切片在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布.石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体以及GFP抗体和细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)抗体免疫荧光双标染色法,以此检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况.结果 移植后1周、1、3个月骨髓嵌合小鼠肝内皆可见GFP阳性细胞,且有随时间减少的趋势,并都可见GFP和Alb双阳性细胞.结论 异体骨髓间充质干细胞可在骨髓嵌合小鼠体内分化为表达Alb和CK18的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路.