基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定食品中金黄色葡萄球菌

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对食源性金黄色葡萄球菌的鉴定效果。方法应用MALDI-TOF MS对210株食源性金黄色葡萄球菌进行鉴定,与传统的生化鉴定结果进行比较,并用SPSS19.0软件分析鉴定结果。结果 MALDI-TOF MS将210株金黄色葡萄球菌鉴定到种、属水平分别为98.10%和1.43%,与VITEK 2鉴定方法无差异(P0.05)。结论 MALDI-TOF MS具有简便、快速、准确等优点,适用于对食源性金黄色葡萄球菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱定性分析啤酒中糖类条件的优化

通过选择不同基质(2,5-二羟基苯甲酸、super DHB、2,4,6-三羟基苯乙酮)和设置不同啤酒样品稀释倍数(从原液到1 000倍稀释),优化了MALDI TOF MS定性分析啤酒中糖类的试验条件。研究结果显示,3种基质中,2,4,6-三羟基苯乙酮应用于MALDI TOF MS对啤酒中糖类表征的能力优于另外两种基质。当以2,4,6-三羟基苯乙酮为基质,啤酒样品稀释10倍时,MALDI TOF MS可达良好的定性分析效果。     

聚合酶链式反应和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定克罗诺杆菌

目的 采用聚合酶链式反应(PCR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术快速鉴定克罗诺杆菌的方法,实现对该菌显色培养基上生长的可疑菌落高通量、低成本初筛。方法 通过内转录间隔区(its)基因设计针对克罗诺杆菌的属特异性引物,以7株参考菌株为对照,对2013年国家食品安全污染物监测网上报、初步鉴定为克罗诺杆菌的214株菌株进行复核鉴定。同时随机挑选其中84株菌,采用MALDI-TOF-MS技术和VITEK革兰阴性细菌鉴定卡鉴定。结果 7株参考菌株的PCR结果与对应大小一致,214株待测菌株PCR结果均为阳性。84株菌MALDI-TOF-MS和VITEK鉴定的结果均为克罗诺杆菌,符合率为100%。结论 PCR和MALDI-TOF-MS技术具有高通量、低成本、耗时短等优势,可以实现大量可疑菌落的初筛,为我国克罗诺杆菌的监测和防控提供技术支持。     

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法溯源分析云南省肉制品中金黄色葡萄球菌

目的 利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术对云南省肉制品中金黄色葡萄球菌进行溯源。方法 通过MALDI-TOF MS, 主成分分析及聚类分析等方法, 对来源于云南省肉制品的88株金黄色葡萄球菌, 包括耐苯唑西林或敏感金黄色葡萄球菌株(MRSA/MSSA)的进行溯源研究。结果 86株金黄色葡萄球菌可鉴定到种的水平, 2株可鉴定到属的水平。用MALDI-TOF MS鉴定金黄色葡萄球菌与生化和血清学方法的分型高度相关, 聚类分析表明, 88株菌株在距离水平为500的情况下被划分为4个类型, 其中5型同数据库中来自欧美的9株标准菌株亲缘关系最近。88株金黄色葡萄球菌中来源相同地区的菌株MALDI-TOF MS肽指纹图谱相似性较好, 相同类别来源或地区来源的金黄色葡萄球菌菌体蛋白表达更为相似, MRSA和MSSA菌株MALDI-TOF MS肽指纹图谱未观察到显著差异。结论 MALDI-TOF MS是一种快速、高敏感、高通量、高精度的金黄色葡萄球菌鉴定技术, 具有良好的可追溯性。     

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的 溶藻弧菌鉴定研究

目的建立快速检测和鉴定溶藻弧菌的方法,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)和SARAMIS分析软件,对来自水产品中的溶藻弧菌进行了检测和鉴定。方法将从样品中分离得到的可疑菌落于37℃纯化培养24、48、72 h后,分别用微生物API生化鉴定系统和MALDI-TOF-MS方法进行分析鉴定,并对MALDI-TOF-MS鉴定方法的稳定性、准确性和重复性进行初步探讨。结果不同的培养时间,24、48和72 h对MALDI-TOF-MS检测的蛋白质谱图影响较小,鉴定值分别为94.10%,93.90%,92.70%;同时用微生物API-20E生化鉴定试剂盒进行辅助分析鉴定,培养24 h后,鉴定值为97.7%,T值为0.47,但培养72 h后,鉴定值为52.4%,T值为0.15。同一样品点样2次,得到的6张图谱显示出峰位置基本一致。用标准菌株大肠埃希菌ATCC 8739和溶藻弧菌ATCC 17749纯化培养24 h后,鉴定值分别为99.90%和97.60%。结论与传统的生化鉴定方法相比,MALDI-TOF-MS和SARAMIS软件分析方法具有较高的稳定性、重复性和准确性,可以快速、准确地鉴定溶藻弧菌,可用于水产品中溶藻弧菌的高通量、低成本的快速检测鉴定。     

水产品中溶藻弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定方法建立

目的建立水产品中溶藻弧菌的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的快速鉴定方法。方法以溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)为研究对象,采集不同样品处理方法 (直接涂抹法和甲酸提取法)、激光强度和菌株传代次数的MALDI-TOF MS图谱并加以分析比较,探讨上述因素对方法准确性的影响。将溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)的MALDI-TOF MS图谱主产物(MSP)添加到数据库中,使用36株分离菌株及8株与溶藻弧菌近缘的弧菌标准菌株验证数据库的补充对鉴定结果可信度的影响。结果甲酸提取法处理所得图谱特征峰多、基线平滑、信噪比高,图谱质量优于直接涂抹法;激光强度对MALDI-TOF MS图谱有影响,过高或过低均会导致图谱质量的下降;标准菌株补充数据库后可提高鉴定可信度,分离株的鉴定分值均达到2.300以上;传代次数对鉴定结果没有影响。结论 MALDI-TOF MS方法可将溶藻弧菌准确鉴定到种水平。该方法准确、可靠,可用于溶藻弧菌的快速鉴定。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在 李斯特菌检测和鉴定中的应用

为建立食品中各种李斯特菌的快速检测和鉴定方法,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5种李斯特菌进行检测,并与传统的生化鉴定方法(VITEK 2)和聚合酶链式反应(PCR)方法检测结果进行比较;用不同培养基和不同培养时间培养的单增李斯特菌对该方法进行检测,还对60份人工感染5种李斯特菌的食品样品分别进行MALDI-TOF-MS、PCR以及传统生化方法的检测和鉴定。结果表明：MALDI-TOF-MS能够快速、可靠地区分上述5种李斯特菌,而且具有很好的稳定性和重复性,在检测时间、重复性和准确性方面的总体表现优于传统生化鉴定方法。MALDI-TOF-MS技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

金黄色葡萄球菌基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱的鉴定与聚类分型

目的 建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time of flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS)快速鉴定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)并自建数据库, 进行聚类分型。方法 基于MALDI-TOF MS技术, 对经全自动微生物分析仪(VITEK2 COMPACT)鉴定为S. aureus的25株分离株和1株标准菌株(ATCC 25923)进行鉴定。并进一步采集26株S. aureus特征性蛋白质指纹图谱, 使用flex Analysis软件进行分析, 汇总成标准图谱并构建本地分离株S. aureus的鉴定数据库, 命名为Staphylococcus aureus。结果 经标准菌株ATCC 25923验证, 自建数据库对S. aureus鉴定结果的可信度较设备自带数据库明显提高, 鉴定分值由2.251提高到了2.845。自建数据库进一步对26株S. aureus进行聚类分型, 在差异水平100时, 24株不同来源S. aureus被聚类成24个分支, 将食品中不同来源分离的S. aureus分为24个型。结论 MALDI-TOF MS作为一种快速、准确、高通量的全新微生物鉴定技术, 实现了对S. aureus的特异性快速鉴定与分型, 能够满足公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面的需求。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术 在微生物检测与鉴定中的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在微生物检测与鉴定中有着广泛的应用前景。本文着重介绍了MALDI-TOF MS分析技术微生物检测原理、前处理技术及其在微生物检测、鉴定、分型、溯源分析中的应用。与传统的检测鉴定方法相比,MALDI-TOF MS分析技术表现出成本低、检测时间短、易于操作等显著的技术优势。随着微生物质谱数据库以及分析方法的逐渐完善,该技术将成为微生物实验室致病菌快速检测鉴定的重要分析手段。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术在微生物鉴定与分型中的应用

微生物的鉴定方法有很多种, 这些方法基于表型、免疫学、遗传学等, 目前普遍采用16S rRNA和18S rRNA基因测序为标准, 但这些方法也有一些局限性, 费时费力、操作复杂、劳动力和试剂成本都很高, 限制了在常规微生物检测实验室的普及与推广。近年来, 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)在微生物学领域的应用越来越重要, 与应用于微生物鉴定的其他技术不同, MALDI-TOF MS更快速、准确、经济且易于操作。随着样品制备、数据库丰富和算法优化的发展, 使用MALDI-TOF MS进行鉴定的准确性和速度不断提高。虽然大多数研究都集中在细菌上, 但这项技术也应用于真菌和病毒。本文对MALDI-TOF MS技术对细菌、真菌、病毒鉴定与分型的研究进展以及目前该技术的局限性进行综述, 旨为该技术在临床诊断、食品检测等领域的多种应用奠定基础。     

Identification of bovine-associated coagulase-negative staphylococci by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using a direct transfer protocol

This study evaluated matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-ToF MS) for the identification of bovine-associated coagulase-negative staphylococci (CNS), a heterogeneous group of different species. Additionally, we aimed to expand the MALDI-ToF MS database with new reference spectra as required to fill the gaps within the existing commercial spectral library. A total of 258 isolates of CNS were used in the study, covering 16 different CNS species. The majority of the isolates were previously identified by rpoB gene sequencing (n = 219), and the remainder were identified by sequencing of 16S rRNA, hsp60, or both rpoB and hsp60. The genotypic identification was considered the gold standard identification. All MALDI-ToF MS identifications were carried out using the direct transfer method. In a preliminary evaluation (n = 32 isolates; 2 of each species) with the existing commercial database, MALDI-ToF MS showed a typeability of 81% (26/32) and an accuracy of 96% (25/26). In the main evaluation (n = 226 isolates), MALDI-ToF MS with the existing commercial Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA) database achieved a typeability of 92.0% (208/226) and an accuracy of 99.5% (207/208). Based on the assessment of the existing commercial database and prior knowledge of the species, a total of 13 custom reference spectra, covering 8 species, were created and added to the commercial database. Using the custom reference spectra expanded database, isolates were identified by MALDI-ToF MS with 100% typeability and 100% accuracy. Whereas the MALDI-ToF MS manufacturer's cutoff for species-level identification is 2.000, the reduction of the species level cutpoint to ≥1.700 improved the species-level identification rates (from 64 to 92% for the existing commercial database) when classifying CNS isolates. Overall, MALDI-ToF MS using the direct transfer method was shown to be a highly reliable tool for the identification of bovine-associated CNS.     

Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

Subclinical mastitis is a common and easily disseminated disease in dairy herds. Its routine diagnosis via bacterial culture and biochemical identification is a difficult and time-consuming process. In this work, we show that matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) allows bacterial identification with high confidence and speed (1 d for bacterial growth and analysis). With the use of MALDI-TOF MS, 33 bacterial culture isolates from milk of different dairy cows from several farms were analyzed, and the results were compared with those obtained by classical biochemical methods. This proof-of-concept case demonstrates the reliability of MALDI-TOF MS bacterial identification, and its increased selectivity as illustrated by the additional identification of coagulase-negative Staphylococcus species and mixed bacterial cultures. Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry considerably accelerates the diagnosis of mastitis pathogens, especially in cases of subclinical mastitis. More immediate and efficient animal management strategies for mastitis and milk quality control in the dairy industry can therefore be applied.     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在食源性致病菌鉴定中的研究进展

;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)具有高效、准确、检测速度快等优点。作为近年来发展的新型食源性致病菌鉴定技术,MALDI-TOF MS为食品病原微生物靶标性监测和食品安全事件应急检验提供了一种高效的鉴别技术参考。本文检索了近年来国内外MALDI-TOF MS技术在食源性致病菌检测中的相关研究,综述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测原理及具体案例,在此基础上分别从参考菌株数据库建设、标准化程序规范等方面对MALDI-TOF MS在食源性致病菌检测领域的研究方向进行展望,以期为后续食品安全检测及快速监管提供技术支持。     

几种不同血清型沙门氏菌生化结果及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱离子峰的差异性分析

目的了解不同血清型沙门氏菌生化结果差异及飞行质谱离子峰的差异性。方法选取10种不同血清型的沙门氏菌,确认其血清种类,使用VITEK2全自动微生物鉴定仪迚行生化分析,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOFMS)获得蛋白质指纹图谱,幵迚行离子峰差异性分析。结果 10株不同血清型沙门氏菌尿素酶、赖氨酸、H_2S等33种生化结果无差异,而L-脯氨酸芳胺酶、乳酸盐产碱、O/129耐受等14个反应结果有个别差异;建立了10株沙门氏菌鉴定分型主要差异的离子峰数据库,幵収现菌株存在完全不同的离子峰:Sal-01具有8370.144离子峰, Sal-03具有5462.553、10927.51离子峰, Sal-06具有3013.925、6035.049离子峰, Sal-07具有3030.747、6026.629、6067.12离子峰。结论不同血清型沙门氏菌在生化结果上有一定的差异,通过MALDI-TOF-MS分析能够获得不同血清型的沙门氏菌具有差异性离子峰基础数据。     

免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定牛奶、鸡蛋中的沙门氏菌

目的建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测牛奶、鸡蛋中沙门氏菌的方法。方法沙门氏菌经免疫磁珠特异性富集后采用MALDI-TOF MS鉴定,并优化富集过程中的抗体、免疫磁珠添加量以及捕获时间,研究其特异性,并用于实际样品中沙门氏菌的检测。结果富集过程最佳反应条件为:每1 mg磁珠中抗体添加量为250μg,1 mL菌样中免疫磁珠添加量为600μL,捕获时间为30 min,免疫磁珠捕获沙门氏菌具有特异性;用于检测牛奶和鸡蛋中的沙门氏菌时,将浓度为3 CFU/mL的沙门氏菌特异性富集后选择性增菌9h即可被MALDI-TOF MS准确鉴定。结论该方法具有选择性好,特异性高,耗时短,结果准确的优点,为食品中沙门氏菌的检测提供相关参考。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,选择性培养基HE和EMB对细菌进行分离纯化。通过MALDI-TOF-MS技术对疑似菌落进行鉴定;提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS鉴定出的细菌种类,参考Gen Bank中相关菌株的已知基因序列分别设计引物,进行PCR扩增、测序和序列比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。结果经MALDI-TOF-MS方法鉴定,从68个疑似菌株中分别检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异变形杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR结果与MALDI-TOF-MS鉴定结果完全一致。结论 MALDI-TOF-MS可用于生鲜猪肉检验过程中大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定。本次共检出6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,说明在生鲜猪肉中存在着一定程度的条件致病性肠道细菌污染,因此具有一定的食品安全风险。     

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱结合化学计量学技术筛查原奶掺假研究

目的 利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF) 结合化学计量学方法快速筛查鲜奶掺假。方法 样品经0.1%三氟乙酸水溶液稀释50倍,与10 mg/mL芥子酸溶液等体积混合,取2 μL混合液点靶板,待样品干燥后载入MALDI-TOF,MALDI-TOF在线性模式下采集数据。通过主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA)分析不同来源的数据,建立鲜奶蛋白质信息数据库。通过检测掺假样品并与数据库进行比较,评估检测方法性能。结果 确定了MALDI-TOF蛋白质图谱可做为鲜奶的指纹图谱。建立了一个涉及2个产地和季节的鲜奶蛋白质信息数据库。方法能够检测含有0.3% (w/w) 猪皮明胶、大豆分离蛋白或乳清蛋白的掺假样品。方法操做简单快速,从进样到获得结果,一个样品仅需几分钟。结论 MALDI-TOF结合化学计量学方法能够快速检测在0.3% (w/w) 浓度下含有猪皮明胶、大豆分离蛋白或乳清蛋白的鲜奶掺假。