HSV_1tk/GCV基因治疗系统的旁观者效应观察

探讨逆转录病毒 (retrovirus ,RV )载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 tk )基因转染 ,联合抗病毒药物核苷类似物羟甲基无环鸟苷 (ganciclovir,GCV )对人卵巢上皮癌细胞系TYK细胞杀伤过程中所产生的旁观者效应。采用脂质体介导法将PLNTK5质粒转入包装细胞PA317后 ,以滴度最高的PA317病毒上清液感染TYK细胞 ,遗传霉素G418筛选后 ,得到带有HSV1 tk基因的TYK细胞。将细胞按不同比例混合培养后 ,给予 10 μg/mlGCV ,4d后用MTT法计算细胞存活率 ,观察旁观者效应。PLNTK5质粒成功转入PA317细胞 ,病毒滴度最高者为 6× 10 5cfu/ml。用病毒上清液感染TYK细胞 ,成功地得到了表达HSV1 tk的卵巢癌细胞株TYK/tk。混合培养结果显示 ,TYK/tk细胞占混合细胞 10 %时 ,低浓度的GCV就可使一半以上的细胞杀死 ,证明了HSV1 tk/GCV治疗方法存在着旁观者效应。逆转录病毒可介导HSV1 tk基因转入TYK细胞并获稳定表达 ,HSV tk/GCV系统存在旁观者效应。     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的 观察HSV-tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色,测定腺病毒的转染率,利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体AdCMVtk.AdCMVtk感染Hep-2细胞后,加入10mg/LGCV。观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 随着腺病毒感染复数量（ultiplicity of infection,MOI)增加,对Hep-2细胞转染率亦增加,100%转染需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系。即有浓度依赖性,此杀伤作用存在旁观者效应,但较弱。结论 腺病毒介导的HSV-tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／Ganciclovir系统对脑胶质瘤动物模型的治疗

目的　探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因 (HSV1 tk)结合Ganciclovir(GCV)治疗方案 ,在脑胶质瘤动物模型中基因治疗的疗效以及杀伤肿瘤细胞的机制。　方法　采用Southern杂交法 ,证实逆转录病毒载体生产细胞系pN2 A tk VPC(VPC)带有tk基因并稳定整合到基因组DNA上 ;再将VPC与人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系DBTRG 0 5MG(0 5MG)分别以 1∶1、1∶4比例混合接种于BALB c裸鼠皮下 (以只接种 0 5MG细胞作为对照 ) ,建立裸鼠皮下胶质瘤动物模型 ,然后腹腔注射GCV治疗 [30mg (kg·d) ],连续 14d ,治疗后 1周 ,取出瘤块作病理组织学分析。　结果　 1∶1组瘤块较 1∶4组和对照组明显减小 (P <0 0 1) ,且有 30 %的瘤块完全消失 ,提示HSV1 tk GCV对肿瘤细胞有显著杀伤效应。光镜观察可见 ,1∶1组细胞核固缩、溶解甚至破裂等坏死特征 ,说明HSV1 tk GCV在invivo水平杀伤肿瘤细胞是细胞毒杀伤效应。　结论　HSV1 tk GCV系统能有效杀伤肿瘤细胞 ,并可能通过旁观者效应扩大肿瘤杀伤效应     

GCV和CTL对HSV-TK/B7基因转染的大鼠乳腺癌细胞杀伤的体外实验

目的　观察羟甲基无环鸟苷 (GCV)、CTL对逆转录病毒介导的转染单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)和共刺激分子 (B7)双基因的大鼠乳腺癌细胞的体外杀伤作用。方法应用基因重组技术 ,构建逆转录病毒载体GcTKpSN、GcpB7SN和GcTKpB7SN。以重组逆转录病毒感染细胞的培养上清液 ,感染大鼠乳腺癌细胞SHZ 88。经G4 18筛选阳性克隆并扩增后 ,给予GCV进行敏感性实验。将从正常SD大鼠脾细胞悬液中分离的T细胞 (CTL) ,与转染重组基因的乳腺癌细胞按不同比例共育后 ,进行细胞杀伤实验。结果　转染与未转染GcTKpB7SN基因的乳腺癌细胞相比较 ,前者对GCV的敏感性明显增强 (P <0 .0 1)。T细胞对经GcTKpB7SN基因修饰的乳腺癌细胞的杀伤作用 ,明显强于未转染Gc TKpB7SN基因的乳腺癌细胞 (P <0 .0 1)。结论　GCV对转染GcTKpB7SN基因的大鼠乳腺癌细胞具有体外杀伤作用。经GcTKpB7SN基因修饰的乳腺癌细胞 ,在体外能被T细胞杀伤。     

单纯疱疹病毒胸苷激素酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）及其底物丙氧乌苷（GCV）的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS－2的杀伤作用。方法：用DOTAP将含有HSV－TK基因的真核表达质粒tgCMV-HyTK导骨肉瘤细胞株SAOS－2;提取阳性转染细胞（SAOS－2TK）的总RNA,用斑点杂交的方法检测HSV－TK基因的表达;用MTT比色法测定SAOS－2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果：SAOS－2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录物;SAOS－2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应,且观察到强效的“旁观者效应”。结论：HSV－TK／GCV系统能够选择性杀死骨瘤细胞。     

可控性大鼠卵巢癌DC活疫苗的制备及其体外研究

目的：制备可控性大鼠卵巢癌树突状细胞（DCs）活疫苗并检测其免疫生物活性。方法：从大鼠Fischer344骨髓前体细胞中分离、扩增DCs，与转导有自杀基因Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-tk）基因的大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19／tk融合制成活疫苗。以流式细胞仪、激光共聚焦显微镜分析此活疫苗的生物学特征；LDH释放法检测其细胞毒活性（CTL）；MTT法测定其对丙氧鸟苷（CCV）的反应性。结果：细胞融合率为28．14％，融合细胞呈典型的双阳性表现，高表达表面分子MHC-Ⅱ（OX6）、B7—2、OX62和ICAM-1。CTL结果显示活疫苗组对亲本肿瘤细胞的杀伤活性最强，死疫苗组次之，DCs与NuTu-19／tk混合组最差（P〈0．01）。100μg/ml GCV对活疫苗的杀伤率为88．42％。结论：卵巢癌DC融合活疫苗在体外可产生明显的抗肿瘤免疫效应，并可通过自杀基因的杀伤作用将其在体外灭活。将自杀基因系统引入肿瘤活疫苗，为制备有效而安全的肿瘤疫苗提供了新思路。     

小檗碱对喉癌Hep-2细胞增殖与凋亡的影响及可能机制

目的探讨小檗碱对喉癌Hep-2细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法免疫组织化学方法与Western blot方法检测喉癌组织及癌旁正常组织中环氧合酶-2(COX-2)与细胞周期调节蛋白CyclinB1的表达。MTT方法检测不同质量浓度小檗碱(0,5,10,20mg/L)对喉癌Hep-2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测小檗碱(0,20 mg/L)对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响。Western blot方法检测小檗碱(0,20 mg/L)作用喉癌Hep-2细胞24h后COX-2与CyclinB1的表达变化。结果 COX-2与CyclinB1在喉癌组织的阳性表达率及平均光密度值显著高于癌旁正常组织(P0.01)。小檗碱抑制喉癌Hep-2细胞增殖,并呈时间浓度依赖性;给予20 mg/L小檗碱作用后,喉癌Hep-2细胞凋亡率明显增加,喉癌Hep-2细胞中的COX-2与CyclinB1表达水平明显低于未加药组(P0.01)。结论小檗碱抑制喉癌Hep-2细胞的增殖并促进凋亡,下调COX-2与CyclinB1的表达可能是其作用机制之一。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应。方法构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达,MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用。结果成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响。结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

Intercellular trafficking and cytotoxicity of recombinant HSV-1 thymidine kinase fused with HSV-2 US11 RXP repeat peptide

To improve the therapeutic efficacy of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) thymidine kinase (tk)/ganciclovir (GCV) therapy, we have made recombinant tk chimeras fused with the arginine-rich (RXP) repeat of herpes simplex virus type 2 (HSV-2) US11 and examined their activity of intercellular trafficking and cytotoxicity. When examined the immunofluorescence staining patterns of RXP/tk fusion proteins in transfected COS7 cells, the RXP chimeras revealed a conservation of the trafficking activity of RXP. We also found that transfection of tkCΔ6-RXP (lacking the C-terminal six amino residues of tk), tk-RXP, and tkNΔ66-RXP (lacking the N-terminal 66 amino residues of tk) induced apoptosis even in the absence of GCV. The results suggest that these tk/RXP chimeras themselves have apoptosis-inducing activity, and that the HSV tk nucleoside-binding domain may be involved in the induction of apoptosis. Furthermore, treatment with 5 μM GCV induced efficient cell death in cells tranfected with tk-RXP in comparison to the cells transfected with tk (P < 0.0001). Chenhong Luo and Akihiro Nawa contributed equally to this work     

Retroviral transfer of HSV1-TK gene into human lung cancer cell line

We used a recombinant retrovirus as one of the potential vectors for human gene therapy to transfer a drug sensitivity gene into human lung cancer cells. The gene encoding the thymidine kinase (TK) of herpes simplex virus type 1 (HSV1) was used as the drug sensitivity gene. The antiherpes drugs acyclovir (ACV) and ganciclovir (GCV) were chosen to test the HSV1-TK activity transferred into the human lung cancer cell lines. The rationale for this approach was that ACV and GCV are nucleoside analogs specifically converted by HSV1-TK to a toxic form capable of inhibiting DNA synthesis or disrupting cellular DNA replication. The results obtained from our experiments demonstrate that the retroviral vector-mediated HSV1-TK gene transfer leads to ACV- and GCV-dependent cytotoxicity in human lung cancer cell lines, including both small-cell carcinoma and nonsmall-cell carcinoma. Although the gene transfer of HSV1-TK gene into tumor cells would be one model for gene therapy to control lung cancer, further investigations are necessary for the proper choice of the therapeutic gene and vector targeting such as tumor cell specific delivery of the gene or tumor cell specific expression of the transduced gene.Abbreviations ACV Acyclovir - GCV Ganciclovir - HSV1 Herpes simplex virus type 1 - LTR Long terminal repeat - TK Thymidine kinase     

自杀基因TK联合细胞因子FL真核表达载体的构建及其相关特性的研究

目的　探讨自杀基因TK(thymidinekinase ,胸苷激酶 )与细胞因子FL(Flt 3ligand ,Flt 3配体 )在同一细胞克隆中表达的特性 ,为肿瘤的基因治疗提供实验基础。方法　构建以IRES(内部核糖体进入位点 )相连的TK与FL的真核表达质粒 ,脂质体法转入人乳腺癌细胞株MCF 7中。MTT法检测GCV(Ganciclovir,更昔洛韦 )对MCF 7/TK FL细胞的杀伤活性 ,电镜、光镜及FACS法检测凋亡情况。ELISA法及Westernblot对该细胞克隆分泌的FL进行定量、定性分析并检测其对CD34 细胞的促增殖活性。结果　构建的pIRES TK FL真核表达质粒以脂质体法可成功转入MCF 7细胞中 ,MCF 7/TK FL细胞可被GCV有效杀伤并存在凋亡情况 ,IC50 值为 0 5 μg/ml。该细胞分泌的FL有蛋白水平的表达 ,ELISA法测定FL分泌量为每 4天 10 5个细胞中 15 7ng/ml,它具有刺激CD34 细胞增殖的活性。结论MCF 7/TK FL细胞可同时表达TK与FL基因 ,在自杀基因瘤苗的基础上 ,其分泌的细胞因子FL具有生物活性 ,可作为进一步加强免疫细胞功能的手段     

带有CMV、CEA误启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性

TK基因一GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一。为了提高基因靶向表达的效率,使之可以应用于体内实验,我们构建重组腺病毒AdCMVTK和带有CMV、CEA两个启动子的AdCMVCEATK,在五种癌细胞中进行了体外实验。发现腺病毒介导的TK基因赋予癌细胞GCV敏感性比对照组高2～3个数量级,并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为110时仍产生较强的“旁观效应”。实验表明PG肺癌,CAn结肠癌,HeLa细胞是腺病毒介导的TK基因的理想靶细胞。     

端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv-tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究

目的研究人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir,Hsv-tk/GCV)治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法(1)用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的tk基因表达质粒(pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk)转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,用逆转录-PCR方法检测转染细胞中tk基因的表达情况;(2)用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;(3)用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果(1)转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549均有tkmRNA表达,转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tkmRNA表达;(2)GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无明显抑制作用;(3)转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞,GCV处理后细胞凋亡指数(21.58%、9.35%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞(0.78%和0.55%)及空白对照A549和MRC-5细胞(2.17%和0.60%),转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达,hTERT调控的Hsv-tk/GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。