奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC7721的体外抗肿瘤作用

目的研究奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC7721生长抑制及诱导凋亡的作用并探讨其机制。方法以不同浓度的奥沙利铂作用于SMMC7721细胞,应用MTT法检测奥沙利铂对SMMC7721细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态学变化;采用分光光度法检测caspase-3、cas-pase-8、caspase-9的活性。结果奥沙利铂可抑制SMMC7721细胞的生长并具有时间和剂量依赖性,Hoechst33258荧光染色可见典型的细胞凋亡特征,流式细胞仪检测到细胞阻滞于S期和SubG1峰。经过奥沙利铂诱导,caspase-3、caspase-9活性被上调,较对照组明显升高（P〈0.05）,caspase-8活性未见明显改变（P〉0.05）。结论奥沙利铂具有抑制肝癌细胞株SMMC7721增殖及诱导凋亡作用,此作用可能通过激活内源性凋亡途径实现。     

腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响

目的：构建蛋白酶体亚基α3（proteasome subunit alpha type 3,PSMA3）基因腺病毒重组载体,并观测腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响。方法：RT-PCR法扩增PSMA3基因全长CDs序列后,克隆入pTG19-T载体,再亚克隆入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,构建重组pAdTrack/PSMA3腺病毒载体,随后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组形成pAd/PSMA3重组腺病毒,经包装及滴度测定,获高感染力的pAd/PSMA3病毒。用pAd/PSMA3病毒感染人肝癌SMMC7721细胞,荧光显微镜观测被感染的SMMC7721细胞的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的变化情况。Cell counting kit-8（CCK-8）法检测pAd/PSMA3病毒对SMMC7721细胞增殖的影响。Real-time PCR和Western blot分别检测被感染的SMMC7721细胞的PSMA3基因、增殖细胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、Caspase-3促凋亡基因及其编码蛋白的表达情况。流式细胞仪（FCM）检测被感染的SMMC7721的周期、凋亡变化。将经pAd/PSMA3病毒感染的SMMC7721细胞移植裸鼠皮下以生成荷瘤,逐日观察荷瘤的生长情况。所有实验以空病毒感染及未感染的细胞做对照。结果：克隆到768 bp的PSMA3基因,并构建了其具高感染力的pAd/PSMA3重组病毒。CCK-8法结果表明,过表达PSMA3基因的SMMC7721细胞,其增殖明显减慢（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot检测显示,pAd/PSMA3重组病毒可介导SMMC7721细胞过表达PSMA3基因,上调其Caspase-3基因及其编码蛋白的表达,并下调其PCNA 基因及其蛋白的表达（P<0.05）。FCM检测证实,过表达PSMA3基因的细胞可被阻滞于G1期（细胞周期）,并可促使其凋亡,其凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。动物实验证实,pAd/PSMA3病毒可明显抑制裸鼠荷瘤的生长（P<0.01）。结论：重组病毒pAd/PSMA3可将SMMC7721细胞阻滞于G1期（细胞周期）,抑制其增殖,促使其凋亡,并可抑制其裸鼠荷瘤的生长,这些可能和下调其增殖相关PCNA蛋白,上调其凋亡相关caspase-3蛋白的表达密切相关。     

体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡时细胞信号转导因子活性变化

目的体外使用顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡,检测细胞转导因子MAPKs及转录因子(JUN,CREB)活性的变化. 方法采用免疫细胞化学法和流式细胞术法. 结果 15 mg*L-1顺铂作用肝癌SMMC-7721培养细胞48 h可观察到明显的凋亡峰,72 h免疫细胞化学染色发现胞质或(和)胞核中MAPKs(JIN/SAPKs,p38MAPK,ERK)及转录因子(JUN, CREB)均有明显表达. 结论在体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中,MAPKs途径(JIN/SAPKs,p38MAPK,ERK)及转录因子(JUN,CREB)参与诱导了细胞凋亡.     

褪黑素对人肝癌SMMC—7721细胞的抑制作用

观察褪黑素对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞生长抑制作用及其作用机理。方法采用不同浓度的褪黑素通过体外细胞培养、ＭＴＴ显色技术研究其抑制作用,以流式细胞仪和电子显微镜技术观察其作用机理。结果褪黑色素对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞具有抑制作用,其ＩＣ３０、ＩＣ５０分别为１．１０和２．００ｍｍｏｌ／Ｌ。以ＩＣ３０的褪黑素处理ＳＭＭＣ－７７２１细胞,使其倍增时间由２１．１ｈ延长到３８．４ｈ。流式细胞仪观察到     

白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡过程中bax和bcl-2基因表达

目的探讨中药白英提取物对肝癌SMMC7721细胞中细胞凋亡相关基因的影响。方法用不同浓度的白英提取物处理肝癌SMMC7721细胞,利用TUNEL法检测其细胞凋亡;通过原位杂交法、免疫组化法,研究白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡时,凋亡促进基因bax和凋亡抑制基因bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果 IPP图像分析表明,bax表达显著增高,bcl-2显著下降。结论白英提取物通过调节细胞凋亡促进基因和抑制基因,从而诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡。     

乙酰咪唑修饰对高密度脂蛋白结合人肝癌SMMC—7721细胞的影响

利用Ｎ－乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白－３（ＨＤＬ３）研究其对ＨＤＬ３结合肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞能力的影响。结果：ＨＤＬ３乙酰咪唑修饰降低其竞争结合作用。这一抑制作用取决于乙酰咪唑浓度，在１ｍｏｌ／Ｌ时达最大抑制。结果提示ＨＤＬ３中酪氨酸残基存在于ＨＤＬ３结人合确认部位，参与ＨＤＬ３的受体结合过程。     

顺铂诱导人肝癌细胞凋亡模型的构建

目的 建立肝癌细胞凋亡模型,探讨顺铂抗癌作用机理,为进一步研究细胞凋亡分子机制打下基础。方法 用抗癌药顺铂诱导增减的人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞发生凋亡,用四氮甲唑蓝比色试验（ＭＴＴ）,细胞形态学检查,ＤＮＡ凝胶电泳检测。结果 顺铂可显著抑制ＳＭＭＣ－７７２１细胞的生长,并有很好的量效和时效关系,经药物作用后,肝癌细胞在显微镜下呈现典型的凋亡形态学改变,ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳吴现明显的梯度     

siRNA介导的新趋化因子VCC-1沉默对人SMMC7721肝癌细胞生长的影响

 目的 探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC27721生长的影响。方法 采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1（(VEGF correlated chemokine 1,VCC-1）)VCC-1基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼脂克隆形成实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞生长的影响。结果 Western blot 结果显示RNA干扰组（shVCC1-1组）细胞VCC-1蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01）; ,MTT法结果显示shVCC1-1组细胞增殖速度、克隆形成率均低于对照组（P<0.05）。结论 siRNA靶向抑制 VCC-1表达可以抑制人SMMC7721肝癌细胞增殖能力及克隆形成能力。     

过表达整合蛋白α5β1的SMMC7721细胞株的建立和鉴定

目的 构建过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株。方法 应用分子克隆技术和基因转染建立过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株，应用ＲＴ－ＰＣＲ及汉式细胞术鉴定ＳＭＭＣ７７２１－细胞表达整合蛋白α５β１，６－７７２１细胞。结论、整事蛋白α５β１基因转染后，ＳＭＭＣ７７２１细胞整合蛋白α５β１的ＲＮＡ及蛋白质表达明显提高。过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株的建立有助于研究整     

多西紫杉醇对缺氧人肝癌细胞株SMMC7721化疗药物的敏感性及其作用机制

目的研究多西紫杉醇缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721的化疗药物的敏感性及其作用机制。方法多西紫杉醇加入化疗药物干预过的人肝癌细胞株SMMC7721中,培养2 d后,MTT法检测SMMC7721中多西紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC7721化疗药物的敏感性,流式细胞仪检测人肝癌细胞株SMMC7721凋亡情况,应用RT-PCR和Western-blot检测人肝癌细胞株SMMC7721中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA和蛋白水平的表达变化。结果缺氧对多西紫杉醇对化疗药物具有协同增效作用,200μmol/L多西紫杉醇增敏指数为2.58。多西紫杉醇诱导的人肝癌细胞株SMMC7721凋亡增加,且表现明显的浓度依赖效应。此外随着多西紫杉醇用药剂量增加,能显著降低HIF-1α的表达。200μmol/L多西紫杉醇组与对照组基因表达比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论缺氧对多西紫杉醇可以通过某种机制下调核转录因子HIF-1α表达,提高缺氧环境中人肝癌细胞株SMMC7721对化疗药物的敏感性。     

稳定过表达、干扰RN181的MHCC97L细胞系建立及RN181功能的初步研究

目的构建过表达和干扰RNl81基因的肝癌MHCC97L重组细胞系，并研究RNl81对该细胞体外增殖的影响。方法基于基因克隆技术，构建plncx2一GFP—IRES／RNl81重组载体，常规鉴定后，与pVSV—G共转染GP2—293细胞包装逆转录病毒。该病毒与RNl81干扰慢病毒分别感染MHCC97L细胞，流式分选表达绿色荧光的细胞，RT—PCR、Westernblotting鉴定后，CCK．8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果重组载体构建成功，重组细胞荧光良好，RT．PCR、Westernblotting分别证实重组细胞中RNl81的mRNA和蛋白表达水平在重组细胞系间均出现差异有统计学意义（P〈0．05）。增殖实验显示RN181上调后细胞生长减慢，克隆数也显著少于对照组（P〈0．05），而RNl81干扰后上述现象可得到逆转。结论成功构建了过表达和干扰RNl81的MHGC97L重组细胞系．初步证实了RNl81在体外对MHCC97L细胞增殖的抑制作用。     

构建稳定干扰RN181的RKO细胞系并研究其生长现象

目的构建稳定干扰RN181的重组RKO细胞系,并研究下调RN181水平后,重组细胞系在体内外生长的规律。方法 RN181干扰慢病毒感染RKO细胞系,荧光与Western blotting鉴定该重组细胞系,CCK-8法、平板克隆实验研究该重组细胞系在体外增殖规律,裸鼠成瘤实验研究其在体内增殖情况。结果重组细胞系荧光良好,Western blotting证实重组细胞干扰组与对照组的RN181表达量差异有统计学意义(P0.05)。体外细胞生长曲线实验与平板克隆结果显示,干扰组与对照组之间增殖能力差异无统计学意义(P0.05)。干扰组的瘤体生长速度明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建稳定干扰RN181的肠癌细胞系,并证实了下调RN181对RKO细胞在体外生长无影响但在体内能显著抑制细胞生长。     

腺正态的急性毒性及其对人肝癌SMMC 7721的抑制作用

1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器酶联免疫检测仪,型号DG3022(华东电子医疗装备集团有限公司);MTT(美国Sigma公司);腺正态(XZT,民间验方),加冷水煮沸3 h,定量浓度为0.125 g*mL-1,高速离心后取上清高压灭菌;MTT;实验动物由第四军医大学实验动物中心提供.     

STAT3基因在人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中的表达及意义

目的：探讨STAT3基因异常活化在人原发性肝癌发生、发展中的作用及可能的机制。方法：应用免疫组化染色法、RT-PCR和Western blotting法检测人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中STAT3基因的mRNA和蛋白水平表达。 结果：肝癌细胞株SMMC7721、Bel7402和HepG2中均有STAT3基因的高表达,3种肝癌细胞间表达量比较差异无显著性（P>0.05）。原发性肝癌组织和癌旁组织中均有STAT3的mRNA及蛋白水平的高表达,与正常肝组织比较差异有显著性（P<0.05）,而肝癌组织与癌旁组织比较差异无显著性（P>0.05）。肝癌组织中VEGF、survivin和c-myc 的mRNA表达上调,p53的mRNA表达下调。结论：STAT3
的异常活化可能发生在癌变的早期,在肝癌的形成和发展中可能起重要的促进作用。     

过表达中期因子增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药及可能机制研究

目的探讨过表达中期因子(MK)增强SMMC 7721细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药及其可能的机制。方法将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(WB)检测MK mRNA和蛋白的表达。5-Fu处理后,采用MTT法检测SMMC 7721细胞对5-Fu的耐药。采用WB法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和NF-κB及Bcl-2、survivin、caspase-3的表达。结果将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达后,MK mRNA和蛋白的表达增加,ConC组细胞对5-Fu的IC50显著高于Con-A组、Con-B组[(27.36±4.31)mg/L vs (4.57±0.34)mg/L,(4.96±0.46)mg/L],差异具有统计学意义(P0.05)。此外,与Con-A组、Con-B组比较,Con-C组细胞p-PI3K(0.66±0.04 vs 0.35±0.03,0.57±0.03)、p-Akt (0.31±0.02 vs 0.17±0.02、0.25±0.02)、NF-κB (0.63±0.05 vs 0.27±0.02,0.53±0.04)、Bcl-2(0.42±0.04 vs 0.13±0.01, 0.38±0.04)、survivin(0.58±0.04 vs 0.18±0.02,0.51±0.04)呈现高表达,caspase-3(0.41±0.04vs 0.88±0.06,0.43±0.03)呈现低表达(P0.05)。结论过表达MK可增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。     

甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡的诱导作用

目的 探讨甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡诱导作用及相关机制.方法 以甘草酸苷(0、10、30、100μg/mL)处理肝癌细胞SMCC-7721 48 h后,咪唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位;紫外分光光度法检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-9活性的影响;Western blot分析线粒体途径中相关蛋白p53、细胞色素C(CytC)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关蛋白(Bax)的表达.结果 与阴性对照比较,10、30、100 μg/mL甘草酸苷可显著降低细胞的活力(P＜0.01),诱导细胞凋亡(P＜0.01),促进线粒体膜电位去极化(P＜0.01),抑制肝癌细胞SMCC-7721Caspase-3、Caspase-9活性(P＜0.01),并上调p53、CytC、Bax的表达(P＜0.01),下调Bcl-2的表达(P＜0.01),且作用呈现浓度依赖关系.结论 甘草酸苷可通过线粒体途径诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡.