DinB基因的超表达短期内可显著降低大肠杆菌的死亡率

[目的]探讨大肠杆菌dinB基因在进化上的选择优势.[方法]应用竞争共培养和超表达的策略,测定共培养后含dinB基因的目的菌株和对照菌株的生长优势.第1组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第2组为含质粒pUC-dinB-rrnb的E..coli AB1157＋含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli YG7207;第3组为含质粒pUC-phoE-rrnb的E.coli AB1157＋含质粒pUC-dinBR-rrnb的E.coli YG7207;第4组为卡那霉素抗性（K^＋）菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157.[结果]第4组中,卡那霉素抗性菌株YG7207与无卡那霉素抗性菌株AB1157在培养物中的比例保持着良好的稳定.第1组和第2组混合培养中,K^＋抗性的菌株在培养物中的比例急剧下降,并很快接近或等于0;第3组培养物中,K^＋菌株（YG7207）的比例呈明显上升.[结论]超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势不是由于对数期的生长速率提高所造成,对数后期细胞死亡率降低应该是超表达dinB基因的大肠杆菌菌株的生长优势的主要原因.     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

大肠杆菌Mn-SOD基因的克隆及表达

目的：实现Mn-SOD基因在大肠杆菌（E.coli）中的可溶性表达,并对表达产物进行活性测定。方法：用PCR方法从大肠杆菌2号基因组中扩增Mn-SOD基因编码区,克隆到pUCm-T Vector,测定核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体PET-28a,构建含Mn-SOD基因的重组表达质粒,转化到大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果：SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50%;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921.8 U/mg,是对照BL21的276.8倍。结论：Mn-SOD基因可在BL21中成功表达,产物具有高可溶性、高活性的特点。     

新型融合基因hIFNα1—CB在大肠杆菌中表达

目的构建人干扰素α1和抗菌肽B的融合蛋白表达质粒pHC,并初步研究融合蛋白的抗病毒活性.方法重组质粒pHC转化E.coli JM83,温控诱导表达,SDS-PAGE制备蛋白质,病变抑制法测定其抗病毒比活性.结果得到分子量约为21ku的目的蛋白,抗病毒比活性为2.62×106IU/mg.结论成功构建了融合蛋白表达质粒pHC,重组蛋白的构象及C-端的β位酰胺化等因素可能影响重组蛋白的生物学活性.     

人内皮生长抑素基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

目的 获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的人重组内皮生长抑素（endostatin)蛋白，以研究其在治疗肿瘤及血管性疾病中的潜在应用价值。方法 从人的胎盘中分离总RNA经反转录聚合酶链反应（RT－PCR），得到endostatin的全基因，并将其与质粒pUCm-T重组，测序证明获及的人内皮生长抑素基因的序列与先前报道一致后，用限制性内切酶将其切下与表达载体pET-11a重组，转化受体菌BL－21（DE3)中，用IPTG诱导以包涵体形式表达，经层析纯化，鸡绒毛尿囊膜血管（CAM）检测活性。结果 经SDS－PAGE检测，重组人内皮生长抑制蛋白的分子量为20KD，表达量约占蛋白总量的40％。纯化后的内皮生长抑素对鸡的绒毛尿囊膜血管的生长有明显的抑制作用。结论 得到了具有生物活性的重组人内皮生长抑素蛋白，为下一步的临床肿瘤及血管性疾病的治疗奠定了基础。     

外源基因在大肠杆菌中表达效率的影响因素

人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因。但不同外源蛋白基因在大肠杆菌中的表达效率差异很大。本文综述了影响外源基因表达效率的一些常见因素,特别是对影响酬译起始的因素给予了更多的关注,同时总结了一些提高外源基因在大肠杆菌中表达效率的行之有效的方法。     

人类乳头瘤病毒16例晚期基因L1大肠杆菌可诱导表达系统的构建

本研究采用亚克隆和序列修饰策略建立了编码人类乳头瘤病毒１６例主要结构蛋白Ｌ１基因的大肠杆菌可诱导表达质粒ｐＴｒｃ９９Ａｍ－ＨＰＶ１６－Ｌ１。通过限制性内切除分析验证了ｐＴｒｃ９９Ａｍ－ＨＰＶ１６－Ｌ１的结构。     

人骨形态发生蛋白-2的基因重组及其在大肠杆菌中的表达

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白２（ｈＢＭＰ２）。方法将包含ｈＢＭＰ２部分前肽和成熟肽的３′端７３０ｂｐｃＤＮＡ片段,插入原核表达载体ｐｋｐＬ３ａ的多克隆位点,构建成ｐＫｐＬ３ａ／ｈＢＭＰ２重组表达载体,转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,挑选阳性克隆,经诱导表达后用ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定。结果该克隆表达的ｈＢＭＰ２为ＭＷ２７０００,表达量占菌体总蛋白１０％,部分纯化后植入大鼠股部肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生及骨与软骨形成。结论说明重组ｈＢＭＰ２具有诱导异位骨与软骨形成的生物学功能。     

致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立

目的 建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段.方法 以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型.采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC 0157:H7 Sakai株和弱毒株EHEC 0157:H7 0013015以及E. coli DH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度.结果 EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05).EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05).结论 成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法.     

ubiCA基因的强化表达及对大肠杆菌辅酶Q生物合成的影响

为调查大肠杆菌高产辅酶Q(CoQ)的可能性,首先研究大肠杆菌生物合成关键基因ubiCA强化表达对大肠杆菌CoQ产量的影响。本文构建了含有ubiCA基因的5个表达质粒,将其分别转入E.coli JM 83或BL 21(DE 3)菌株中,定量分析这些转化子的辅酶Q产量。结果表明ubiCA基因在ubiC自身启动子(pub iCA-lacZF)介导下的表达最有效,重组菌CoQ产量达到对照的3.5倍,由此推测ubiCA基因的表达可能与其启动子序列有关。     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

Isolation of a novel polyvalent virulent bacteriophage of E.coli

Objective：To isolate virulent bacteriophage from environment samples and explore the potential way of decontaminating the environmental wastewater. Methods： The standard plaque assay, negative staining transmission electron microscopy （TEM）, genome extraction and nucleases test were used to isolate bacteriophages. Then its morphology and characteristics were examined. Results： A novel bacteriophage XY-1 was isolated from a sewage pond in a hospital. It infected and killed 6 E.coli reference strains. The phage had a round head （diameter 40-50 nm）, no tail and the genome was ssRNA of approximately 5.0 kb. It was able to reduce E.coli to an extent of 44.63% to 67.00% when being added into the samples of different raw sewage water, depending on the contact time, the temperature and the phage dose. Conclusion： From the morphology typical and nucleotide characteristics （RNA） of the genome of phage, phage XY-1 appears to be closely related to phage f2. It may have some effects for the control of E.coli in sewage water.     

动物粪便中肠道出血性大肠杆菌PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。【方法】按照华大基因公布的检测肠道出血性大肠杆菌的方法,应用PCR的方法检测腹泻动物粪便中分离到的大肠杆菌Stx2-2基因和AFF-I-2基因。【结果】在分离到的45株大肠杆菌中,Stx2-2基因阳性菌株有7株,AFF-I-2基因阳性菌株有22株,其中2种基因阳性菌株有2株,其血清型分别为O142和O127:K63。【结论】成功建立了快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。     

婴儿腹泻患者分离出大肠杆菌的药敏及R质粒检测

作者对从婴儿腹泻患者粪便分离的84株大肠杆菌,做了药敏性和接合性R质粒的检测。共检出对链霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素及氨苄、青霉素6种抗生素的耐药菌80株,占95.2％。对检出的80株耐药菌进行接合试验,R质粒的平均检出率为92.5％。讨论部分还将本文结果与正常人群大肠杆菌的药敏及R质粒检出结果,做了比较分析。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

牛生长抑素基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中克隆表达牛生长抑素基因并初步纯化。方法：根据牛生长抑素基因序列，按照大肠杆菌偏爱密码子设计合成2个DNA片段，经退火、Klenow酶补平及连接反应，获得牛生长抑素基因片段；经PCR扩增、EcoRⅠ和BarnHⅠ酶切，牛生长抑素基因被克隆在表达质粒pALEX中。结果：将重组质粒转化BL21(DE3)，经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和GST—Sepharose 4B亲和层析纯化获得重组蛋白。结论：牛生长抑素基因得到了高水平表达并初步纯化，为表达产物的大量制备、进一步的结构功能关系及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础。