逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

携带Egr-1基因调控序列的TK基因的腺病毒载体的构建

目的：构建以GFP做标志基因的放射敏感基因Egr-1调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herps simplex virus thymidine kinase，TK）的腺病毒载体。方法：以PCl-neo-Egr-1-TK（oET）为模板扩增Egr-1，插入到pAdTrack的XbaⅠ和XhoⅠ位点。构建重组质粒pAdTrack／Egr-1；与pET酶切获得TKcDNA相连，构成pAdTrack／Egr-1-TK；用PmeI酶切后与pAdEasy-1混合。应用细菌内同源重组法获得重组表达质粒pAdEgr-1-TK。结果：重组表达质粒pAdEgr-1-TK的酶切鉴定符合预期结果，感染肿瘤细胞可见绿色荧光表达。结论：通过细菌内同源重组成功构建含GFP做标志基因的pAdEgr-1．TK重组表达质粒，为研究Egr-1调控自杀基因及对肿瘤细胞进行灭活打下了基础。     

B7联合HSV-TK基因对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）和共同刺激因子Ｂ７基因联合作用对乳腺癌动物模型的体内治疗作用。方法：应用重组技术,构建分别携带ＨＳＶ－ＴＫ,Ｂ７及ＨＳＶ－ＴＫ／Ｂ７双基因的逆转录现毒载体。以ＳＨＺ－８８细胞细胞株建立乳腺癌动物模型,随机分为组、ＴＫ组、Ｂ７组及ＴＫ／Ｂ７组,每组２０只。２周后于瘤体内分别注射转染有空载及不同的重组载体的乳腺癌细胞,３天后于腹腔内连续     

“两步转化法”高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体

目的 采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法 将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌，制备AdEasy-1细菌；自载体pBS-CD中切出CD基因，亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上，构建的pAdtrackCMV-CD线性化后转化AdEasy-1细菌，抽提同源重组腺病毒质粒，PacⅠ酶切后转染293细胞，在293细胞中包装与扩增，利用GFP报告基因进行滴度测定。同时按“一步转化法”进行同样的重组腺病毒制备，比较二的优劣性。结果 “两步转化法”终产物17个克隆中13个正确，正确率为76．5％(13／17)；“一步转化法”重组产物17个克隆中有2个正确，正确率为11．8％(2／17)，两具有显性差异(P=0．00017)。结论 “两步转化法”细菌内同源重组是一种更高效、更方便的重组腺病毒制备方法。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究

目的 为探讨HSV－TK／GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应。方法 台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739－TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究。结果 HSV－TK／GCV系统有效的杀伤T739－TK细胞，且这种作用有明显的旁观者效应，旁观者效应的强弱与T739－TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关。结论 HSV－TK／GCV系统不仅能有效的杀伤T739－TK细胞，而且对T739细胞有明显的旁观者效应。     

含HSV-TK基因的重组腺病毒的构建及其对肿瘤细胞的抑制作用

目的 :构建含HSV -TK基因的重组腺病毒AdTK并观察AdTK/GCV系统对体外培养的PG49、H460、MCF -7和HeLa4种肿瘤细胞株的抑制作用。方法 :采用同源重组法构建AdTK ;用MTT法测定细胞生长抑制率。结果 :已成功构建了AdTK ;AdTK/GCV系统对4种肿瘤细胞的生长抑制率随AdTK、GCV浓度及作用时间的增加而升高。结论 :所构建的AdTK/GCV系统对4种肿瘤细胞株有明显的抑制作用     

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV－TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV－TK基因的真核表达载体pCR3-5K,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中，筛选出阳性克隆，给予不同浓度的ACV，观察不同时间对细胞的杀伤情况，并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高（P＜0．01），ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3-TK转移，进行胶质瘤HSV－TK／GCV基因治疗的研究，为胶质瘤的治疗提供一种新方法。     

细菌内重组法高效制备含人Fas基因的重组体腺病毒

目的 制备含人Fas基因的重组腺病毒,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 应用高效细菌内同源重组系统Ad-Easy,自PMD-T-Fas质粒中切取Fas基因,将Fas基因克隆到穿梭质粒,在BJ5183细菌内重组,最后在293细胞中构建携带Fas基因的重组腺病毒．将腺病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测转染前后Fas蛋白的表达的变化及蛋白的功能。结果 通过Ad-Easy系统成功构建高滴度的携带Fas基因的重组腺病毒Ad-Fas,Ad-Fas感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后能稳定提高Fas蛋白的表达,并且在Fas单克隆抗体的诱导下可以发现明显的细胞凋亡。结论 (1)构建的重组腺病毒Ad-Fas在体外实验中能有效地提高瘢痕疙瘩成纤维细胞蛋白的表达,并且可以重建原来阻断的死亡信号传导通道。(2)再次证实了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系,为瘢痕疙瘩基因治疗开辟了一条新途径。     

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的 观察HSV—TK／GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应。方法 用逆转录病各感染鼠源性膀胱癌细胞T739，以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型，同时，在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤，观察GCV治疗俯后肿瘤大小变化及动物存活时间。结果 动物存活时问随基因转移效率提高而延长，腹腔肿瘤生长受到抑制，背部肿瘤在50％以上转移效率时肿瘤生长缓侵。结论 HSlV—TK／GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高，并存在远距离旁观者效应。     

HSV-TK/GCV系统对鼠膀胱癌远距离旁观者效应的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK）基因联合羟基无环鸟苷(GCV)对体内膀胱癌的远距离旁观者效应的效果。方法将转染HSV-TK基因的膀胱癌细胞和未转染HSV—TK的膀胱癌细胞分别种植于小鼠双侧背部;给予GCV治疗,观察肿瘤的大小变化,小鼠存活天数改变,及膀胱癌细胞病理学改变。结果在HSV—TK/GCV系统作用下,转染HSV-TK的TK 肿瘤大小明显小于对照组,肿瘤生长受到抑制;但对侧未转染HSV-TK基因的TK-肿瘤产生远距离旁观者效应不明显。结论HSV—TK／GCV系统对体内其他部位未转染HSV-TK基因膀胱癌细胞产生远距离旁观者效应不明显。     

神经胶质瘤基因治疗中旁观者效应的动物试验

目的：探讨单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）Ｉ型胸苷激酶（ＴＫ）基因逆转录病毒载体生长细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用Ｃ６，Ｃ６ＸＳＮ，Ｃ６ＴＫ及不同比例的ＴＫ（＋）和ＴＫ（－）混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，５ｄ后动物腹腔内注射ＧＣＶ溶液，剂量为１５ｍｇ／ｋｇ，每日２次，共１０ｄ。细胞接种后３周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的     

腺病毒载体介导的VEGF165基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究

目的 探讨局部应用以腺病毒为载体的血管内皮生长因子(Ad-VEGF165)基因治疗对大鼠缺血皮瓣生存的影响.方法 选用SD大鼠30只,体重350～400 g,随机分成3组,每组10只,在其背部形成8 cm×2 cm的全厚随意型皮瓣.于皮瓣远端皮下分别注射携带血管内皮生长因子基因的腺病毒(Ad-VEGF165目的基因组,简称VEGF165组),携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP基因组对照,简称GFP组),磷酸盐缓冲液(PBS空白对照组,简称PBS组),48 h后按原设计掀起皮瓣并原位缝合,术后7天,测量皮瓣的成活面积,计算成活面积百分比,并采集成活皮瓣组织行免疫组化、组织学检查等.结果 皮瓣成活面积百分比VEGF165组为(69.4±1.3)%,GFP组为(52.2±1.7)%,PBS组为(52.9±2.9)%,VEGF165组皮瓣成活面积百分比明显高于GFP组和PBS组(P＜0.01).免疫组化显示VEGF165组毛细血管周围VEGF沉积,组织切片微血管密度明显高于GFP组和PBS组(P＜0.01).结论 局部皮下注射Ad-VEGF165可诱导局部VEGF蛋白表达,促进新生血管的形成,提高缺血皮瓣的成活面积,是一种简单有效的基因治疗方法.     

Experimental Study of Adenovirus Vector Mediated-hVEGF165 Gene on Prevention of Restenosis after Angioplasty

This study evaluated the effects of adenovirus vector mediated human vascular endotheli-al growth factor-165 (hVEGF165) gene on prevention of restenosis after angioplasty. Rabbit models of bilateral carotid artery injury were established by balloon denudation. The recombinant adenovi-ruses containing hVEGF165 cDNA was directly injected into left side of the injured carotid arteries.On day 3 and week 3 after transfection the expression of VEGF was observed by RT-PCR and im-munohistochemistry. The thrombokinesis, reendothelialization (rET) and intimal hyperplasia in ca-rotid arteries were evaluated by computerized image analysis system 3 weeks after gene transfer,The changes in the VEGF gene-treated side were compared with the control side. Our results showed that 3 days and 3 weeks after hVEGF165 gene transfer the VEGF mRNA and antigen ex-pression were detected in vivo. 3 weeks after the transfer, the carotid artery rET was markedly better in the VEGF gene-treated group compared with the control. The thrombokinesis, intima are-a/media area (I/M), maximal intimal and medial thicknesses (ITmax and MTmax) demonstrated a statistically significant decrease in arteries treated with VEGF gene as compared with the control group. It is concluded that VEGF gene transfer could be achieved by intra-arterial injection of re-combinant adenoviruses. It might accelerate the restoration of endothelial integrity, inhibit throm-bokinesis and attenuate intimal hyperplasia in the injured arteries after VEGF gene transfer. This procedure could be useful in preventing restenosis after angioplasty.     

Ad-Flk1-Fc抗膀胱肿瘤血管生成作用研究

目的：研究Ad-Flk1-Fc对膀胱肿瘤血管生成的抑制作用.方法：建立膀胱肿瘤皮下移植瘤模型,对照组及肿瘤组随机瘤内注射PBS及Ad-Flk1-Fc（2×10^9PFU）,2次/wk,共2wk.观察瘤内注射Ad-Flk1-Fc后肿瘤体积变化,并采用免疫组化法测定微血管密度（MVD）.结果：治疗组与对照组的肿瘤体积、质量、MVD值两组间差异有统计学意义.结论：Ad-Flk1-Fc能够有效抑制膀胱肿瘤的血管生成,并抑制肿瘤生长.     

pLTKcSN／VPC及GCV系统的旁观者效应观察

目的：探讨单纯疱疹病毒Ｉ型胸苷激酶基因（ＴＫ）逆转录病毒载体生产细菌（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中的旁观者效应。方法：采用大鼠胶质瘤细胞Ｃ６、人恶性胶质瘤Ｕ８７ＭＧ和它们的转染ＴＫ阳性细胞Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＴＫ，将Ｃ６与Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＭＧ和Ｕ８７ＴＫ按比例（ＴＫ阳性细胞占细胞总体的０－１００％，１０％梯度）分别混合培养于９６孔板中，每种混合比例设６孔。     

顺铂对鼠胶质瘤SHG-44细胞的增殖抑制和辐射增敏作用

目的:观察顺铂对鼠胶质瘤SHG-44细胞的抑制及放射增敏作用,并探讨其作用机制。方法:不同浓度紫杉醇(0、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml和5μg/ml)作用于SHG-44细胞,MTT法检测顺铂对SHG-44细胞的增殖抑制作用;克隆形成法检测细胞辐射敏感性变化,流式细胞术检测细胞凋亡百分率变化。结果:顺铂有明显的抑制SHG-44细胞增殖和提高其放射敏感性的作用,顺铂可提高3 Gy、6 Gy照射24 h后SHG-44细胞的凋亡率。结论:顺铂对人胶质瘤SH-44细胞具有杀伤及放射增敏作用。其可能机制是加强射线对肿瘤细胞的诱导凋亡效应,增加其杀伤肿瘤作用。     

腺病毒介导的HSV-TK基因系统联合羟基喜树碱对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的HSV-TK系统联合羟基喜树碱(HCPT)对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用.方法 使用含有HSV-TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒转染人膀胱癌细胞T-24细胞,表达GFP为转染成功标志,同时观察转染率,PCR检测TK表达.以正常T-24细胞为空白对照,转染成功后分别加入GCV、GCV HCPT,采用MTT法测定单纯HCPT作用于人膀胱癌细胞72 h细胞增殖抑制率、各组治疗转染后人膀胱细胞24、48、72 h细胞存活率;流式细胞仪检测GCV(0.5 mg/ml) HCPT(10 mg/L)作用T-24细胞4h后的凋亡情况.结果 随着浓度的增高,HCPT对T-24细胞的生长抑制率逐渐增高,HCPT浓度为0.01 mg/L时T-24生长抑制率为14%,50 mg/L时T-24生长抑制率为63%,当HCPT浓度大于100 mg/L时,抑制作用无明显增加(P=0.216).GCV组、GCV HCPT各组对转染后细胞有明显杀伤作用(P=0.00),GCV HCPT组随HCPT浓度增高和作用时间的延长,杀伤效率明显增高.0.5 mg/ml GCV单独作用于转染后的膀胱癌细胞72 h后,细胞存活率为34.6%,GCV(0.5 mg/m1) HCPT(10 mg/L)组的细胞存活率仅为8.07%(P=0.00).GCV 10 mg/mlHCPT作用后4h,T-24细胞出现M1期前典型的细胞凋亡峰,凋亡率达52.93%.结论 HSV-TK/GCV系统联合HCPT治疗能增强自杀基因系统对人膀胱癌的杀伤作用,能够良好地诱导人膀胱癌细胞的凋亡.