体外诱导条件下大鼠骨髓基质细胞骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达

目的 研究体外培养大鼠骨髓基质细胞诱导条件下，成骨分化标志骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA水平的表达。方法 采用成骨诱导剂（含地塞米松10^-8mol/L,β甘油磷酸钠10mmol/L和抗坏敌国酸AA50μg/ml)对培养状态下的不同代大鼠骨髓基质细胞进行成骨诱导，提取RNA，采用RT-PCR方法，以β-肌动蛋白cDNA为内参照，检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果 与对照组相比，接受成骨诱导剂作用的大鼠骨髓基质细胞随诱导时间的延长骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA出现高表达，且维生素D为诱导骨钙素mRNA表达的必需成分。结论 体外培养的大鼠骨髓基质细胞保持成骨未分化状态，无骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达，诱导后可向成骨分化，骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达升高。     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的 研究大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法 使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松（Dex)10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠（β-GP）10mmol/L,抗坏血酸（AA）50μg/ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明,rMSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,利用MTT法和流式细胞术（FCM）测定增殖的结果表明,传代次数增加,rMSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨、在诱导3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示,非诱导条件下MSCs的碱性磷酸酶（ALP）水平会随传代而升高,传3代rMSCs的ALP的表达较弱,诱导一周后ALP的表达明显升高,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞（OB）的ALP表达。结论 本实验表明所培养的rMSCs仍处于低分化水平,具有骨祖细胞的特性。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的　研究大鼠骨髓基质细胞 (r MSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法　使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松 (Dex) 10 - 8mol/ L、β-甘油磷酸钠 (β- GP) 10 mm ol/ L,抗坏血酸 (AA) 5 0 μg/ ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果　形态学观察表明 ,r MSCs贴壁细胞呈集落生长 ,有成纤维细胞样外观。利用 MTT法和流式细胞术 (FCM)测定增殖的结果表明 ,传代次数增加 ,r MSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖 ,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨 ,在诱导 3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示 ,非诱导条件下 MSCs的碱性磷酸酶 (AL P)水平会随传代而升高。传 3代 r MSCs的 AL P的表达较弱 ,诱导一周后 AL P的表达明显升高 ,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞 (OB)的 AL P表达。结论　本实验表明所培养的 r MSCs仍处于低分化水平 ,具有骨祖细胞的特性。     

合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用

目的研究合成成骨生长肽（sOGP）对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的作用，并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比。方法取大鼠股骨骨髓，贴壁法分离骨髓基质干细胞进行体外培养，加入不同浓度的sOGP，观察细胞形态变化，细胞增殖率，细胞内碱性磷酸酶（ALP）的表达，RT—PCR法检测3种主要成骨标志物（ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素）的表达，组织化学染色检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达及钙质的沉积并进行图像分析。结果sOGP对BMSCs增殖的影响随浓度不同呈现双向作用。sOGP和地塞米松在mRNA和蛋白水平均能促进各成骨标志物的表达，定量分析结果显示，sOGP在10^-9mol／L浓度组促成骨的作用最强，明显高于对照组和地塞米松组。结论sOGP能明显促进大鼠BMSCs向成骨方向转化。这种促成骨能力与其浓度密切相关，以10^-9mol／L浓度下促成骨能力最强。     

福莫特罗和ICI118551对大鼠骨髓间充质干细胞来源的成骨样细胞功能的影响

目的:研究选择性β2肾上腺素能激动剂福莫特罗(Formoterol)和阻滞剂ICI118551对体外由大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)成骨分化的影响,探讨β2肾上腺素能受体信号对骨代谢的影响.方法:取3周龄雌性SD大鼠,全贴肇筛选法培养MMSC.用条件培养液诱导向成骨细胞分化后分别加入不同浓度Formoterol和ICI118551,检测细胞碱性磷酸酶,骨钙素的分泌水平和细胞增殖率.结果:MMSC成功诱导分化为成骨样细胞,不同浓度(10-5～10-9mmol/L)的Formoterol均可抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖.高浓度ICI118551(10-5和10-6mmol/L)抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖,低浓度ICI118551(10-8和10-9mmol/L)则可促进成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖.结论:β2肾上腺素能受体激动剂可抑制体外成骨样细胞的功能和细胞增殖,而阻滞剂对成骨样细胞功能和增殖的影响与其浓度有关.     

成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A—WMGC支架材料联合培养的实验研究

目的 研究多孔磁性硅灰石/磷灰石玻璃陶瓷载体A-WMGC支架(apatite-wollastonite magnetic glass ceramic,A-WMGC)作为组织工程骨支架的可行性.方法 体外培养兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导剂地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后A-WMGC支架复合,通过倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况.结果 地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原.A-WMGC支架具有合适的微孔结构,材料大孔孔径为300～400μm,且孔道相互贯通,体外复合培养10小时,成骨细胞即开始贴附于支架上,复合培养7天,成骨细胞在支架上分化增殖,分泌细胞外基质.结论 适当浓度成骨诱导剂可成功的将兔BMSCS成骨细胞诱导,修饰后A-WMGC支架是骨组织工程的良好载体.     

RNA干扰Axin2对大鼠骨髓基质干细胞的成骨分化表达的影响

目的 通过对大鼠Axin2基因的RNA干扰(RNAi),探讨Axin2对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化过程的影响.方法 取6周龄雌性SD大鼠双侧股、胫骨骨髓细胞,采用全骨髓培养法进行原代和传代培养.细胞传2代后实验组进行Axin2 mRNA干扰质粒转染,对照组进行阴性干扰质粒转染.转染48 h后换用成骨诱导分化培养基.诱导分化28 d后用 von Kossa方法进行细胞外基质矿化染色.采用适时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术检测诱导分化后第7、14天β-catenin、骨钙素(OCN)、frizzled-2、Lef-1、Wnt5a mRNA的表达水平.结果 对照组大鼠BMSCs经体外诱导后分化为具备矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞,而实验组BMSCs成骨分化不全;RQ-PCR检测显示,诱导分化后第7天实验组β-catenin、frizzled-2 mRNA表达水平显著低于对照组,而OCN、Lef-1、Wnt5a mRNA表达水平显著高于对照组;诱导分化后第14天实验组frizzled-2、Lef-1和Wnt5a mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05).结论 对大鼠BMSCs Axin2进行RNAi后,BMSCs向成骨细胞分化晚期细胞外基质矿化能力减弱.     

基因沉默组织型转谷氨酰胺酶抑制SaOS-2细胞成骨分化

目的 研究组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase, TG2）是否参与人SaOS-2细胞系成骨分化过程。方法 使用携带短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）的慢病毒转染SaOS-2细胞以敲减TG2表达，以SaOS-2细胞及转染了含阴性对照shRNA病毒的SaOS-2作为对照组，分别进行体外成骨诱导培养，并进行以下检测：1）诱导14 d后各组矿化情况（茜素红染色），2）诱导4 d、7 d后碱性磷酸酶活性及I型胶原、骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的mRNA表达，并与诱导前的表达水平相比较。结果 SaOS-2细胞组及转染阴性对照shRNA组在体外成骨诱导过程中I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达和ALP活性逐渐增加，14 d时形成明显矿化结节，而TG2敲减后的SaOS-2细胞在诱导14 d时矿化水平显著低于对照组，诱导7 d时ALP活性及I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达水平显著低于对照组。结论 组织型转谷氨酰胺酶参与SaOS-2细胞体外成骨分化及矿化。     

熟地强筋合剂对大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察熟地强筋合剂在骨髓基质细胞向成骨分化过程中的作用。方法:采用体外培养大鼠骨髓基质细胞,分别观察各含药血清组碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原染色情况;取各组不同时间点培养液测定碱性磷酸酶比活性及骨钙素含量。结果:碱性磷酸酶染色强弱顺序为D组>C组>B组,Ⅰ型胶原染色强弱顺序为D组>C组>B组>A组,碱性磷酸酶比活性各加药组与对照组比较明显提高(P<0.05);各加药组与对照组比较BGP含量均明显提高。结论:熟地强筋合剂能促进大鼠骨髓基质细胞增殖,诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

促骨髓基质干细胞成骨分化因子研究现状

骨髓基质干细胞（BMSCS）是具有多项分化潜能的干细胞，体外诱导培养表达成骨、神经分化等细胞表型是现代研究热点及难点。现代医学对其促分化及影响因子进行了积极的科研探索。现代基础研究多应用骨髓基质干细胞经典成骨诱导基本辅剂（地塞米松、β—黼磷酸钠和维生素C）培养促进BMSCS成骨分化。在基础研究时常把碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白、骨钙蛋白和I型胶原等作为评判促成骨分化效果的重要量化指标。现将近年来研究较多的促成骨分化细胞因子综述如下。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖分化的影响

目的 研究成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.方法 在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中加入不同浓度的OGP(10-11～10-7 mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测细胞内核心结合因子1(Cbfa1) mRNA的表达.结果 OGP对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P《0.05),最大效应浓度为10-9 mol/L;能增加细胞内ALP活性(P《0.05),最大效应浓度为10-8 mol/L;可诱导Cbfa1 mRNA的表达(P《0.05).结论 OGP可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内Cbfa1 mRNA的表达促进其成骨向的分化.     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

幼龄及成龄鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

目的比较幼龄及成龄大鼠骨髓基质干细胞体外培养过程中生物学特性的差异.方法取3周及3月龄SD大鼠股骨骨髓原代培养基质干细胞.第2代细胞添加诱导成骨培养液,分别通过相差显微镜观察细胞生长,MTT法检测细胞增殖,钙钴法、茜素红染色了解体外矿化,测定细胞总蛋白含量,RT-PCR测Ⅰ型胶原mRNA表达,透射电镜了解细胞及胞外基质分泌来比较两者差异.结果幼鼠细胞增殖更快,倍增时间4.8 d;培养第7天出现较多集落;钙钴法、茜素红染色深染细胞数目多,结节典型;细胞总蛋白含量高.成龄鼠细胞增殖相对慢,倍增时间5.4 d;未见细胞集落,钙化呈片状;细胞总蛋白含量较低.两者琼脂糖电泳均可显示Ⅰ型胶原mRNA条带;超微结构内质网丰富,胞外基质为前胶原样结构.结论不同鼠龄的骨髓基质干细胞经体外诱导均可分化为成骨细胞,考虑到细胞增殖及成骨潜能,幼鼠基质干细胞是研究细胞/生物材料相互作用更理想的工具.     

不同来源人骨髓基质干细胞的生物学特性研究

目的 探讨不同来源人骨髓基质干细胞（hBMSC）体外培养的生物学特性.方法 取不同疾病患者不同部位骨髓体外分离、培养hBMSC,同时应用β-甘油磷酸钠、地塞米松对获得的hBMSC进行体外诱导分化,检测干预后hBMSC的 ALP、Ⅰ型胶原mRNA表达情况.结果 培养的细胞体外增殖迅速,细胞的CD34、CD45阴性表达,CD29、CD90阳性表达,诱导后ALP、Ⅰ和Ⅴ型胶原mRNA阳性表达.结论 人体多种部位均可获得具有未分化潜能的人骨髓基质干细胞.     

成骨生长肽对成骨细胞样细胞的分化和成骨作用

目的"研究成骨生长肽(OGP)对大鼠成骨细胞样细胞的分化和成骨作用.方法"大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞体外培养分实验组与对照组,实验组加OGP,分别测定细胞的Ⅰ型胶原mRNA和骨钙素mRNA表达、胶原和钙含量;测定细胞和培养液的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量. 结果"实验组细胞的Ⅰ型胶原mRNA和骨钙素mRNA均高度表达,对照组相对较低;实验组细胞的胶原和钙含量、细胞和培养液的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均显著地高于对照组(P＜0.05,P＜0.001). 结论"OGP能上调成骨细胞样细胞的Ⅰ型胶原mRNA和骨钙素mRNA表达,增加细胞的胶原合成、分泌和钙盐沉积,由此促进成骨.     

瞬时干扰PPARγ基因促进酒精诱导下人骨髓基质干细胞成骨分化的实验研究

目的 研究应用RNAi(RNA interference)技术靶向PPARγ基因对酒精诱导下人类骨髓基质细胞(hBMSCs)成骨分化的促进作用及对其成脂分化的抑制作用.方法 分离培养hBMSCs,经传代后应用脂质体包裹后的PPARγ-siRNA在体外转染hBMSC,然后在酒精诱导成脂分化的条件下培养转染后的细胞,应用组织学和分之生物学的方法观测细胞成脂-成骨分化情况并进行定量分析.结果 组织学染色及定量显示,在酒精诱导成脂条件下,PPARγ-siRNA转染组的脂肪细胞形成率明显低于酒精成脂诱导组(P=0.002);而干扰组的钙结节行成率明显高于酒精成脂诱导组(P=0.000).分之生物学检测结果显示,PPARγ-siRNA可明显从mRNA和蛋白水平上调hBMSCs成骨定向分化的特异性转录因子(Osf2/Cbfal)、成骨分化过程中的早期标志Ⅰ型胶原的表达和合成,并通过促进碱性磷酸酶和骨钙素的蛋白合成促进成骨分化.结论 应用siRNA干扰技术靶向PPARγ基因可有效促进酒精作用下的人骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,并且能抑制其向脂肪细胞分化.siRNA可为酒精性骨质疏松的基因治疗和分子机制的研究提供新策略.     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

转化生长因子-β3诱导大鼠前软骨干细胞成软骨分化的量效作用

目的研究转化生长因子-β3（TGF-β3）诱导大鼠前软骨干细胞（PSCs）向软骨方向分化的可行性以及剂量效应关系。方法在体外将分离纯化的大鼠PSCs置于含有不同剂量TGF-β3的诱导培养液中培养,依据其浓度分为5个实验组和1个对照组（不含TGF-β3）,观察细胞生长情况,分别进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果细胞生长良好。免疫组织化学检测对照组Ⅱ型胶原表达阴性,而含TGF-β3的诱导培养液诱导的各组细胞Ⅱ型胶原表达均阳性,其中10μg/L组阳性率最高。RT-PCR半定量检测也显示10μg/L组Ⅱ型胶原mRNA表达量最多,与其它组比较,差异均有显著意义（P〈0.05）。结论TGF-β3在体外能有效诱导PSCs向软骨细胞定向分化。TGF-β3对PSCs促分化作用存在剂量依赖性。