hDaxx即时高表达增强HBVX蛋白对HepG2凋亡的抑制作用

[目的]研究乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）与hDaxx的相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响。[方法]构建pGBKT7-hDaXX和pGADT7-HBx酵母表达载体，利用酵母双杂交系统检测HBx与hDaxx的相互作用。将HBVX基因转染HepG2细胞，建立稳定表达HBx的HepG2X细胞株；pcDNA3．1-hDaxx转染HepG2x，5-Fu诱导凋亡，流式细胞术检测凋亡。[结果]共转pG—BKT7-hDaxx和pGADT7-HBx酵母质粒的酵母菌能在SD／-Trp—Leu—His（三缺）和SD／-Trp—Leu—His—Ade（四缺）的平板上生长，且Western blot检测到hDaxx和HBx在同一株酵母菌中的表达；稳定转染HBVX基因的HepG2细胞组凋亡率明显低于HepG2细胞组（P〈0．01）；且转染pcD—NA3．1-hDaxx后，细胞凋亡率进一步降低，与pcDNA3．1-hDaxx没有剂量依赖关系。[结论]HBx与hDaxx在酵母细胞内存在相互作用；hDaxx的即时高表达可增强HBx对5-Fu诱导的HepG2凋亡作用．HBx可能通过与hDaxx相互作用而抑制HepG2凋亡。     

HBx基因转染胆管癌QBC939细胞对其凋亡的影响及作用机制的研究

目的:探讨乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virus x, HBx)转染胆管癌QBC939细胞引起凋亡及其发生的可能机制.方法:将构建有HBx基因的真核表达载体pcDNA3-x采用脂质体转染法瞬时转染QBC939细胞, RT-PCR及Western 印迹法鉴定HBx在QBC939细胞中的表达;DAPI染色后荧光显微镜镜下观察细胞核的改变,结合FCM法检测细胞的凋亡;以未转染和转染空质粒pcDNA3的QBC939细胞为对照,Western印迹法检测Bax、Bak、Bid、Bcl-XL、CytC、p65的表达;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的变化;RT-PCR法检测Fas和c-myc在mRNA水平的表达;双荧光素酶报告系统分析细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的转录活性.结果:RT-PCR及Western印迹法检测均证实转染后的QBC939细胞中有HBx的表达;DAPI显示转染细胞核呈现固缩且边缘化等细胞凋亡特征性的改变;FCM检测结果显示,转染HBx组与对照组相比,凋亡细胞数量明显增多;Western 印迹法检测结果显示,Bcl-2家族中Bax表达升高,Bcl-XL下降,p65在核内的表达水平升高,细胞质中细胞色素C( cytochrome C)表达升高;RT-PCR结果显示,Fas和c-myc的mRNA水平均高于对照组;JC-1染色法结果显示ΔΨm下降;双荧光素酶报告系统分析提示NF-κB的转录活性升高.结论:成功将HBx基因转入QBC939细胞中,HBx可能是通过调节Fas/FasL死亡受体途径,Bcl-2家族引起的线粒体路径及NF-κB的激活、c-myc等凋亡相关基因的表达而引起QBC939细胞的凋亡.     

肝细胞癌中HBx蛋白与p21蛋白表达的关系及其意义

[目的]研究HBx蛋白对细胞周期的影响及其在肝细胞癌发生中的作用：[方法]采用SP免疫组化方法分别检测HCC组织中HBx蛋白和p21蛋白表达及PCNA。[结果]HCC组织中HBx蛋白的阳性率为52．5％(21／40)，阳性信号多呈核型，阳性细胞多呈区域性或簇状分布：p21蛋白阳性表达随HBx蛋白表达的增强而下降；HCC组织中HBx蛋白表达阳性病例PCNA评分高于阴性病例，p21蛋白表达的阳性病例PCNA评分低于阴性病例。[结论]在HCC的发生过程中，HBx蛋白可影响p21蛋白的表达，推进细胞周期，导致细胞增殖和促进肝细胞的恶性转化。     

稳定转染HBx基因的HepG2细胞株的建立及其对p53-p21途径的影响

目的 将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株, 并研究转染后对p53-p21途径的影响。 方法 用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx 转染入肝癌细胞HepG2中, G418筛选出稳定转染X基因的细胞株。细胞生长曲线、平板克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的恶性表型,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测p53蛋白的表达,RT-PCR检测p21基因。结果 成功筛选出pcDNA3.1-HBx稳定转染的HepG2细胞株;细胞生长实验、平板克隆形成实验显示稳定转染乙型肝炎病毒X基因的肝癌细胞恶性表型增高;流式细胞仪结果显示,转染后的细胞株凋亡率增高,G₁/G₀期细胞减少,G₂期细胞增多;Western blot 和RT-PCR分别显示,转染株p53蛋白表达增高,且下调p21基因水平。 结论 乙型肝炎病毒X蛋白可刺激肝癌细胞生长, 稳定转染X基因的细胞株可能通过p53-p21途径增加肝癌细胞的恶性表型。     

稳定表达HBx的HepG2细胞对罗格列酮敏感性的影响及其机制研究

目的：构建稳定表达x基因编码的乙型肝炎病毒x蛋白（x protein of hepatitis B virus，HBx）的HepG2细胞，检测其对罗格列酮敏感性的变化，并探讨HBx与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）之间的相互作用在原发性肝癌形成过程中的可能机制。方法：构建plRES2-HBx真核表达质粒，筛选稳定表达HBx的HepG2细胞；MTT法检测细胞对罗格列酮的敏感性；免疫细胞化学法检测PPARγ定位的变化；RT—PCR和Western印迹法检测PPART的表达。结果：成功构建pIRES2-HBx真核表达质粒，获得稳定表达HBx的HepG2细胞；罗格列酮对该细胞的抑制作用明显降低（P〈0．05），经丝裂原活化蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase／extra-cellular signalregulated kinase kinase 1，MEK1）抑制剂PD98059预处理后，抑制率有所回升；PPARγ表达量变化的差异无统计学意义，但在细胞中的表达位置发生改变，即从细胞核转至细胞质。结论：HBx可降低HepG2细胞对罗格列酮的敏感性，可能的机制是HBx可改变PPARγ在细胞内的定位以及与DNA的结合能力．并通过磷酸化狳径影响PPARγ与配体的结合能力及其活性。     

甲醛对HepG2细胞脂肪代谢的影响

目的： 探讨甲醛对HepG2细胞甘油三酯 (triglyceride,TG)含量的影响及其可能机制。方法：以0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mmol/L的甲醛 (formaldehyde,FA)分别处理人肝癌HepG2细胞24和48 h,采用CCK-8法检测细胞活性,GPO-POD 酶法测定细胞内TG含量。另分别以0.004、0.02、0.1 mmol/L的甲醛处理人肝癌HepG2细胞24和48 h,采用Western blot法检测肉碱棕榈酰转移酶1 (carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)、固醇调节元件结合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protern-1c,SREBP-1c)、腺苷酸核糖基化因子1 (ADP-ribosylation factor 1,Arf1)和包被蛋白Ⅰ (coat protein comlex Ⅰ,COPⅠ)的蛋白表达水平。结果：与对照组比较,0.5～12.5 mmol/L FA染毒24 h或0.1～12.5 mmol/L染毒48 h 时可显著降低HepG2细胞活性 (P均<0.05);0.1 mmol/L FA染毒24 h,或者0.1 和0.02 mmol/L FA染毒48 h,均可致HepG2细胞内TG含量显著升高 (P均<0.05);FA染毒48 h引起肝细胞内CPT1表达水平明显降低 (P均<0.05),SREBP-1c和COPⅠ表达水平在染毒24和48 h后均增高 (P均<0.05),FA染毒24 h后 Arf1表达水平明显增加 (P<0.05)。结论：FA接触可引起HepG2细胞内TG含量增加,其机制可能与脂肪酸β氧化受到抑制和脂肪合成增加有关。     

RNAi技术对APMCF1基因表达的抑制作用及其对HepG2细胞的影响

目的:采用RNAi抑制APMCF1基因表达,并观察其对HepG2细胞生长和细胞周期的影响。方法:根据APMCF1基因序列及其二级结构特征,设计并合成针对APMCF1基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUNeo载体,并采用脂质体介导法将其稳定转染至人肝癌细胞系HepG2,RT-PCR检测siRNA对靶基因mRNA的抑制效果,然后采用MTT实验、流式细胞仪等对细胞的生长及细胞周期进行观察。结果:HepG2细胞的APMCF1基因表达被成功的抑制。APMCF1基因表达受抑制的HepG2细胞的生长速度加快;细胞周期发生改变,G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多,差异具有显著性。结论:HepG2细胞的APMCF1基因表达被成功的抑制。APMCF1基因对HepG2细胞的生长和细胞周期有明显的调节作用,可能是一个侯选的细胞周期调节基因。     

CYP1A1、β-catenin基因多态性及HBx与肝癌的关系

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国及亚非地区较常见的恶性肿瘤。目前对导致肝癌发生的具体病因还不是很清楚，致癌物的大量接触是肝癌发生的一个重要原因，但是在同样的条件下有的人患病，有的人不患病，这提示遗传易感性在其中起着重要的作用。分子流行病学研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是高发地区肝细胞癌发生的基本病因。HBV长期感染，经常发生病毒基因整合到肝细胞的DNA中。HBV4个基因中的X基因被认为是潜在的致癌基因。此外，CYP1A1（cytochrome P4501A1，CYP1A1）在化学物诱导人类癌症过程中扮演着重要角色嘲。β-catenin基因在肝癌组织中有较高表达。因此近年来人们把目光转向了用分子生物学技术研究肿瘤易感基因与肝癌的关系。本文对近年来有关CYP1A1、β-catenin基因多态性及HBx与肝癌关系的研究作一综述。     

缺氧时肝癌HepG2细胞HIF-1α对GLUT-1表达的影响及机制探讨

目的探讨缺氧状态下肝癌HepG2细胞中HIF-1α表达对GLUT-1的影响。方法 HepG2人肝癌细胞株,以DMEM培养基加胎牛血清培养,分为常氧对照组(21%O2),缺氧组(1%O2),常氧加吲哚美辛组,缺氧加吲哚美辛组。收获细胞后,分别行免疫荧光法检测细胞内HIF-1α的表达和核转位;Western blot检测各组的HIF-1α、GLUT-1蛋白表达;RT-PCR检测各组的GLUT-1mRNA含量。结果缺氧时HIF-1α(蛋白:68.25±11.72)和GLUT-1(mRNA:0.7424±0.1127;蛋白:70.33±12.83)在肝癌HepG2细胞中的表达增高(P<0.05);缺氧时以吲哚美辛抑制HIF-1α蛋白(36.34±9.50)稳定和积聚后,GLUT-1 mRNA(0.3710±0.1016)及蛋白(38.46±12.20)表达受到抑制(P<0.05)。结论缺氧可以上调HIF-1α和GLUT-1在肝癌HepG2细胞中的表达;HIF-1α可以调控其下游靶基因GLUT-1的转录和表达,影响糖酵解和细胞能量的产生。     

HBx Downregulates miR-422a Expression via Activation of FOXG1/Q1/E1 in HepG2 Cells

microRNA-422a (miR-422a) is downregulated in many hematopoietic tumors and solid tumors including hepatocellular carcinoma. We previously demonstrated that hepatitis B virus X protein (HBx) downregulated expression of miR-422a in HCC cell line HepG2 in vitro. However, we explore the mechanisms underlying this action. Forkhead box proteins (FOX) G1/Q1/E1 are known to negatively regulate miR-422a expression, and this prompted us to determine whether HBx suppresses miR-422a expression via activation of FOXG1/Q1/E1. The relationship between FOXG1/Q1/E1 and miR-422a in HepG2 cells stably expressing HBx was assessed with qRT-PCR. The correlation between HBx and FOXG1/Q1/E1 was determined with qRT-PCR and western blot in vitro. The cell cycle and CCK-8 assays were used to elucidate the consequence of miR-422a transfection in HepG2-hbx cells. FOXG1/Q1/E1 activated by HBx was found to be responsible, at least in part, for the downregulation of miR-422a in HepG2 cells. miR-422a transfection hampered the growth of HepG2-hbx cells by arresting cells in G1 phase. Both FOXG1/Q1/E1 and miR-422a may be suitable molecular targets for treatment of HBV-infected HCC.     

短发夹RNA抑制肝癌细胞HepG2 COX-2基因表达的探讨

目的：研究shRNA对肝癌细胞株HepG2中COX-2基因表达的抑制作用,同时检测对细胞周期和细胞生长的影响。方法：设计、合成一对环氧化酶-2（COX-2）基因编码的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,定向克隆至质粒载体pGenesil-1,构建抑制COX-2基因的短发夹RNA（short hairpin RNA shRNA）的重组表达质粒pshRNA-COX-2,用脂质体Lipofectamine^TM2000转染肝癌细胞HepG2,经RT-PCR和Westernblot分别检测pshRNA-COX-2重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白抑制效应,流式细胞仪检测细胞周期、细胞计数检测细胞生长变化。结果：pshRNA-COX-2重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染肝癌细胞HepG2相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒转染肝癌细胞后,COX-2 mRNA和蛋白表达明显降低,抑制率分别为69.9%和50.3%;G0-G1期细胞由55.4%上升为77.9%,S期细胞由31.1%下降为16.2%;细胞生长明显减慢。结论：构建的pshRNA-COX-2重组表达载体能够显著抑制COX-2基因表达;引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而阻止肝癌细胞生长。     

Correlation of constitutive activation of raf-1 with morphological transformation and abrogation of tyrosine phosphorylation of distinct sets of proteins in human squamous carcinoma cells

We and others have reported an association between raf-1 protein serine/threonine kinase activity and transformation of mammalian cells. Because constitutive tyrosine phosphorylation of specific polypeptides is, in general, indicative of the transformed state of cells, we investigated the effect of activation of raf-1 on phosphotyrosine-containing proteins in a human head and neck squamous cell carcinoma-derived cell line, PCI-06A. raf-1 expression and activity were modulated in PCI-06A cells by means of stable DNA transfection of either the entire coding domain of the human c-raf-1 cDNA (in the sense or antisense orientation) of a fragment of c-raf-1 cDNA coding for the kinase domain of raf-1. Our data showed that constitutive activation of raf-1 correlated with morphological transformation, whereas the inhibition of raf-1 expression and activity had no detectable effect on cell morphology as compared with the untransfected cells. Immunoprecipitation of whole-cell lysates with anti-phosphotyrosine antibody followed by anti-phosphotyrosine immunol lotting revealed four phosphotyrosine-containing proteins of approximately 129, 120, 110, and 63 kDa (I–IV, respectively) in the antisense c-raf-1 cDNA-transfected cells showing relatively diminished raf-1 activity but not in the transfectants expressing activated raf. We concluded that tyrosine phosphorylation of I–IV proteins is abrogated in PCI-06A squamous carcinoma cells transformed with constitutively active raf-1 protein kinase. Mol.Carcinog. 18:1–6, 1997. © 1997 Wiley-Liss, Inc.     

转ARL-1基因HepG2细胞耐药相关基因的筛选

背景与目的:醛糖还原酶相似基因1(aldose-reductaselikegene-1,ARL-1)在原发性肝癌中高表达,与肝癌细胞对化疗药物耐药有关。本研究拟建立转染ARL-1的人肝癌细胞株,观察转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物耐药性的改变,利用基因表达谱芯片筛选HepG2细胞转染ARL-1后差异表达耐药相关基因。方法:采用脂质体转染PBK/ARL-1质粒到HepG2细胞,获得高表达ARL-1的单克隆细胞株;RT-PCR、流式免疫荧光和免疫组化鉴定高表达ARL-1的HepG2细胞;应用MTT法和细胞凋亡分析研究HepG2细胞和转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物阿霉素(ADM)和丝裂霉素(MMC)的耐药性,以5-氟尿嘧啶(5-FU)(不含醛基)为对照;将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记两种细胞的cDNA探针,与人肝癌基因表达谱芯片进行杂交与扫描,观察转染ARL-1基因HepG2与对照组HepG2细胞在基因表达谱方面的差异,筛选耐药相关基因,并运用RT-PCR和Westernblot对部分差异表达相关基因进行初步证实。结果:与对照组HepG2细胞相比,转染ARL-1基因HepG2细胞高表达ARL-1蛋白,明显增强对含醛基的抗肿瘤药物如ADM、MMC的耐药性,分别提高2.6倍和3.47倍,用5-FU处理两组细胞,则未发现有明显的耐药差异(ADM组t=6.39,P<0.05;MMC组t=30.06,P<0.01;5-FU组t=0.684,P>0.05);芯片扫描结     

Cyclin E、CDK2和p21WAF1在食管上皮癌变过程中的表达及意义

目的探讨食管上皮癌变过程中细胞周期调控因子cyclin E、CDK2和p21WAF1的表达状况及其意义.方法应用免疫组化SP法和原位杂交方法分别检测48例食管癌组织、31例非典型增生组织和17例正常食管粘膜中cyclin E、CDK2和p21WAF1蛋白及mRNA表达.应用半定量RT-PCR和Western blot检测22例新鲜食管癌及相应癌旁组织的mRNA和蛋白表达.结果从食管正常粘膜、非典型增生组织到癌组织,cyclin E和CDK2蛋白和mRNA阳性表达率逐渐上升,差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).食管癌组织中cyclin E、CDK2和p21WAF1蛋白及mRNA高表达,与癌旁组织或切缘正常食管粘膜有显著性差异(P＜0.01).cyclin E、CDK2和p21WAF1基因表达显著正相关(P＜0.01或P＜0.05).结论食管上皮癌变过程中,细胞周期相关基因cyclin E和CDK2表达逐渐增强.cyclin E基因表达异常是食管癌变过程中的早期事件.p21WAF1基因在食管癌中高表达,可能与细胞周期调控的反馈机制有关.     

苦参碱对白血病细胞癌基因和细胞周期调控蛋白表达的影响

目的：探讨在苦参碱诱导下,白血病细胞株K562增殖和分化时相关癌基因及细胞周期调控蛋白表达表达的改变及意义。方法：应用分子生物学Norhern Blot和DotBlot杂交技术检测人红白细胞病细胞株K562在苦参碱作用后的c-myc,N-ras及p53mRN表达;同时用Western BLotting-ECL分析苦参碱作用前、后24、48、72小时K562细胞Cyclin D1,CyclinE,Ddk2,Cdk5的不同表达水平。结果：在增殖的K562细胞（培养48小时）中,伴随着DNA合成增加,CyclinE和Cdk2保持高表达;而在苦参碱作用24小时分化启动的细胞中,随着DNA合成减少,N-ras,p53mRNA表达增强;c-myc mRNA表达明显受抑;同时CyclinD,Cdk5表达增强,结论：若参碱抑制K562细胞增殖并诱导分化可能与相关癌基因表达和CyclinD1/Cdk5,CyclinE/Cdk2不同表达有关。