人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的：自行构建人血小板源性生长因子B（PDGF-B）真核表达载体，为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法：实验于2002-01／2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据GeIlbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列，设计合成一对附加BamHⅠ，XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段，将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。⑧经测序鉴定后，再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因，构建了基因重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究，在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的:自行构建人血小板源性生长因子B(PDGF-B)真核表达载体,为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法:实验于2002-01/2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据Genbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列,设计合成一对附加BamHⅠ,XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段,将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。③经测序鉴定后,再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因,构建了基因重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究,在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

转录因子T-bet/GATA-3的表达与Th1/Th2分化的相关性研究

辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2细胞之间的相互平衡在免疫应答中起关键作用,两者均从Th0细胞分化而来.Th1/Th2细胞的分化受多种因素影响,如抗原类型和浓度、抗原提呈细胞类型、局部微环境、黏附分子、激素等,其中局部微环境的调节尤为重要.而转录因子即具有重要的调节功能.转录因子T-bet和GATA-3是2种细胞内的分子,分别特异性地表达于Th1细胞和Th2细胞,并最终决定Th0向Th1/Th2的分化[1].     

中国人TFPI-2基因的克隆及测序分析

目的对中国人的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因进行克隆并测序。方法从人新鲜肝组织提取总RNA，经逆转录PCR(RT—PCR)扩增出TFPI-2的全长cDNA，经亚克隆、筛选、鉴定后，进行正反测序。结果中国人TFPI-2基因cDNA全长1222bp，除258bp、585bp和884bp处与目前GenBank中收录的国外学者克隆的TFPI-2基因序列不同外，其他完全一致。其序列GenBank登记号：TFPI AY691946。结论中国人TFPI-2基因序列与已经报道的西方人的TFPI-2基因序列基本相同，但三处单核苷酸多态性的意义何在，目前尚不清楚。     

人von Willebrand因子A1区基因的克隆和表达

为了深入研究血栓形成的机制以及开发新的抗血栓药物 ,将人vonWillebrand(vWF)因子A1区cDNA在大肠杆菌中表达 ,以获得高效表达的具有生物学活性的重组A1区蛋白 ,应用PCR方法从含有人全长vWFcDNA质粒中扩增A1区基因片段 ,并将其克隆至pUCm T载体中 ,经DNA序列分析后 ,将其重组于有 6×HisTag的融合蛋白表达载体pQE 31中 ,并在大肠杆菌M1 5中诱导表达。采用Ni NTA柱进行纯化 ,用Western印迹鉴定。结果表明 ,PCR扩增得到 854bp的A1区基因片段 ,序列测定结果与文献报道一致。IPTG诱导 5小时后表达的vWF因子A1蛋白占菌体总蛋白的 30 %左右 ,经Ni NTA纯化后其纯度在 95 %以上。Western印迹检测显示A1蛋白具有很好的抗原性和特异性。结论 :成功地在大肠杆菌中高效表达了人vWFA1区蛋白 ,为进一步研究vWF在血栓形成与止血中的作用奠定了基础     

中国人TFPI-2基因的克隆及测序分析

目的对中国人的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因进行克隆并测序。方法从人新鲜肝组织提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出TFPI-2的全长cDNA,经亚克隆、筛选、鉴定后,进行正反测序。结果中国人TFPI-2基因cDNA全长1222bp,除258bp、585bp和884bp处与目前GenBank中收录的国外学者克隆的TFPI-2基因序列不同外,其他完全一致。其序列Gen-Bank登记号TFPI AY691946。结论中国人TFPI-2基因序列与已经报道的西方人的TFPI-2基因序列基本相同,但三处单核苷酸多态性的意义何在,目前尚不清楚。     

T-bet:一种新的T细胞分化转录因子

T-bet是一种新发现的属于T-box家族的转录因子,在CD4~+ Th1型细胞的分化中起重要作用。除了CD4~+ Th1细胞,T-bet还可以在NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中表达。IFNγ是T-bet表达的最有效的诱导物,T-bet能够反式激活IFNγ基因,抑制Th2细胞因子的合成,因此在细胞免疫介导的疾病中有重要的作用。     

肽刺激培养法体外扩增巨细胞病毒特异细胞毒性T淋巴细胞

目的研制一种扩增特异细胞毒性T淋巴细胞频数的方法。方法用不同浓度的巨细胞病毒（CMV）特异的表位肽pp65刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）使CMV特异CTLs在PBMCs中的百分比增高。用四聚体一PE和CD。一FITC双标记PBMCs中的CMV特异CTLs，然后用流式细胞仪分析。结果这个方法能有效扩增CMV特异CTLs，使在外周血中占淋巴细胞百分比不到l％的CMV特异CTLs迅速增加到接近20％，占CDsT淋巴细胞的40％以上，并能从单份血样中获得大量特异CTLs用于流式分析。结论肽刺激培养法简便、易操作，能有效扩增CMV特异CTLs，使不同人的数据更容易对比和连续的评价。该方法也为过继性免疫疗法治疗巨细胞病毒疾病打下了基础。     

慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增

本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34 细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病 免疫功能。从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34 细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养。 首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产 生:同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照。获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分 析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细 胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34 细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34 细 胞总数扩增77±5倍。用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)％,细胞扩增倍数及 DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P<0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML 细胞。结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱 导产生抗白血病免疫反应。     

人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的从尖锐湿疣病变组织中克隆人乳头瘤病毒6型(HPV6)E7基因,为HPV感染的检测及基因工程疫苗的研制奠定基础。方法以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术,从尖锐湿疣病变组织中扩增出人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架,并插入载体PMD-18T中构建重组质粒,转化JM109中扩增,进行酶切及测序分析。结果测序结果证实克隆成功。结论该实验为研究人乳头瘤病毒E7蛋白的免疫学和流行病学特点创造了条件,也为下一步制备HPV6型疫苗奠定了基础。     

宫颈上皮内瘤变中hTERC基因扩增状况的研究

目的 探讨人染色体端粒酶基因(hTERC)在宫颈病变中的表达及其临床意义.方法 采用荧光原位杂交方法 检测20例正常宫颈和100例有不同程度宫颈病变的脱落细胞学标本及10例宫颈鳞癌组织标本中hTERC基因的表达情况.结果 hTERC基因在正常组、ASCUS、ASCUS-H、LSIL和HSIL组中的阳性表达率分别为0、19.44%、57.14%、41.86%和71.43%;在正常组、CIN1、CIN2、CIN3和宫颈鳞癌组中的阳性表达率分别为12.5%、60%、66.67%、75%和100%.hTERC基因在正常组与上皮内瘤变各组以及与宫颈鳞癌组组间比较差异显著.结论 hTERC基因高表达在宫颈癌发生、发展中可能起重要作用,采用FISH检测hTERC基因有望成为宫颈癌早期筛查的方法 之一.     

小鼠髓源性树突状细胞的体外扩增及生物学特性的鉴定

目的以小鼠骨髓细胞为前体,建立一种高效、简便的体外扩增、分离培养树突状细胞(DC)的方法。方法实验分为GM/4组和GM/4-α组,以重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白介素-4(rmIL-4)对小鼠骨髓细胞联合诱导培养,GM/4-α组在第5天添加rmTNF-α继续培养48 h,GM/4组不加并于第5天时终止培养;分别收集第5天、第7天的悬浮及疏松贴壁细胞,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面分子,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测2组细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果所收集的2组细胞均具有典型DC形态,细胞表面高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,表达率达75%以上;GM/4组DC细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ的表达率分别为30.5%、34.2%、45.1%,GM/4-α组则分别为78.7%、88.3%、96.7%;MIR中GM/4组DC刺激同种异体T细胞活化增殖的能力不如GM/4-α组强。结论此种方法能于体外定向诱导和扩增出大量髓源性DC,这为后续研究DC在器官移植后诱导机体免疫耐受的机制奠定了基础。     

人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定

背景:由于肿瘤存在个体差异,对癌株的研究不能准确反映个体之间的差异,原代细胞培养则与体内状态更相近。目的:体外培养建立宫颈癌细胞原代培养方法。方法:采用胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法从23例新鲜宫颈癌组织获取宫颈癌细胞,测定其细胞生长曲线,并用免疫荧光染色检测细胞表面标记物CD44、CK17进行鉴定。结果与结论:23例中有21例成功从宫颈癌组织中获取宫颈癌细胞并能连续传代,稳定增殖,免疫荧光染色显示宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性。说明胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法能成功分离原代宫颈癌细胞。     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

人巨细胞病毒gB基因的构建、表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）gB基因,并对pET28a／gB重组质粒进行诱导表达,鉴定表达的目的蛋白。方法根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物,并在引物的5’、3’端分剐加入BarnHI、EcoRI限制性内切酶位点。特异性扩增gB编码基因片段,同时构建舍HCMVgB编码基因的原核表达载体,对重组质粒进行诱导表达,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）法对纯化的Ni／gB融合蛋白的灵敏度和特异度等生物活性进行鉴定,灵敏度可达95％,特异度达96．7％。结果目的蛋白经诱导后表达于上清液中,经鉴定,目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性。结论Ni／gB融合蛋白的获得,为研制以重组蛋白代替传统全病毒作为检测抗原的新型HCMV特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础。     

无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细胞与鉴定

背景:最近有研究者采用神经干细胞的无血清培养基从脑肿瘤组织中培养出肿瘤干细胞.目的:探讨利用无血清培养基从原发胶质母细胞瘤组织中分离培养胶质瘤千细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08在山东省青岛市脑科研究所完成.材料:胶质瘤组织来自青岛大学医学院附属医院神经外科手术切除标本,DMEM/F12培养基、B27为GIBCO公司产品,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子Peprotech公司产品.方法:无菌条件下取肿瘤深部无坏死囊变、来电凝组织,剪切消化成单细胞悬液后,加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂的无血清DMEM/F12培养基,体外分离培养获得胶质瘤干细胞.待培养孔中细胞团数量增多、培养液刚刚变色时,吸取含有细胞团的培养液进行传代.取第3代胶质瘤十细胞,加入巢蛋白和CD133抗体行免疫荧光检测;加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导5 d,行胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色观察分化情况.主要观察指标:原代与传代培养的胶质瘤干细胞形态及生长情况,胶质瘤干细胞巢蛋白、CD133的表达及其分化.结果:原代培养7-10 d可形成大小不一的细胞团,球形或近似球形,呈悬浮或半悬浮状态牛长.细胞形态均,折光性好:传代24 h后次代细胞团形成,细胞的大小,形态与原代无明显差别,连续传代5次后细胞团增殖活跃.第3代胶质瘤干细胞呈巢蛋白和CD133阳性表达,加入胎牛血清后细胞球贴壁分化,呈胶质纤维酸性蛋白阳性.结论:人脑胶质瘤组织中存在胶质瘤下细胞,在体外无血清条件下可保持未分化的悬浮状态;加入血清后贴壁分化呈胶质瘤细胞样或神经元样,符合于细胞的自我繁殖和多向分化特征.     

T-bet表达在预测急性移植物抗宿主病中的作用

目的研究T辅助细胞转录因子T bet在急性移植物抗宿主病 (aGVHD)发生过程中的作用 ,评估T bet与aGVHD的相关性。方法以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测 2 0例异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)患者预处理前、0、移植后 14 ( 14 )、 2 8、 42天骨髓单个核细胞(MNC)T betmRNA的表达变化。结果allo HSCT患者出现aGVHD时 ,骨髓MNCT betmRNA的表达较出现前增高 ,治疗后降低 ; 14天 ,在T betmRNA的表达较预处理前增高的 12例患者中有11例 (91.7% )发生aGVHD ,表达未增高的 8例患者中有 1例 (12 .5 % )发生aGVHD。结论　allo HSCT后患者T betmRNA的表达较预处理前增高 ,发生aGVHD的可能性大。用定量或半定量RT PCR方法检测T betmRNA的表达有助于指导aGVHD的诊断和治疗情况的监测     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。