pFLAG-CMV-TRAF1真核表达载体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建人TRAF1真核表达载体,应用荧光素酶报告基因实验研究TRAF1对NF-κB报告基因活性的影响.方法 采用PCR技术扩增出TRAF1编码基因,将其构到真核表达载体pFlag-CMV-2上.用脂质体将构建的真核表达载体瞬时转染HEK293细胞,用Western blot检测TRAF1蛋白是否表达.用荧光素酶报告基因实验验证其对NF-κB转录活性的影响.结果 成功克降TRAF1编码基因至相应表达载体上.构建的TRAF1真核表达载体使HEK293细胞高表达TRAF1蛋白;在肿瘤坏死因子(TNF-α)的刺激下可以抑制NF-κB的转录活性.结论 TRAF1负调控NF-κB的活性,为进一步研究TRAF1的功能提供了线索.     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

细胞角蛋白18真核表达载体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建人细胞角蛋白18(CK18)真核表达载体,以研究CK18与NF-κB信号通路的关系.方法 经PCR扩增CK18基因片段,用pCMV-Myc及pDsRed1-N1载体构建真核重组质粒,瞬时转染HEK293细胞,用Western blot方法检测pCMV-Myc-CK18的表达,在荧光显微镜下观察pDsRed1-N1-CK18的定位情况.用双荧光素酶报告基因系统,检测CK18对NF-κB信号通路的影响.结果 构建了人CK18真核表达载体,发现CK18定位于细胞质,并抑制NFκB的转录活性.结论 构建了人CK18真核表达载体,CK18负调控NF-κB信号通路.     

小鼠Tim-３真核表达载体pTARGET-Tim-3的构建

目的 构建小鼠Tim-3真核表达载体,并在黑色素瘤细胞系B16中表达小鼠TIM-3。方法 以脾细胞RNA为模板,逆转录PCR扩增鼠Tim-3编码区基因,T-A克隆至真核表达载体pTARGET,构建重组质粒pTARGET-Tim-3,采用脂质体转染法转染黑色素瘤细胞系B16细胞,以逆转录PCR和Western blot验证Tim-3在B16细胞中的表达。结果 利用酶切和测序的方法,筛选、鉴定pTARGET-Tim-3真核表达载体,转染黑色素瘤细胞系B16细胞,经逆转录PCR和Western blot证实TIM-3高效表达。结论 成功构建小鼠Tim-3真核表达载体, Tim-3在转染的小鼠B16细胞系中高表达。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达。方法采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达。结果构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×10³的融合蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的 构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体.方法 以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞.结果 PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT.质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体.     

Menin对SOX4基因表达调控的初步研究

目的 探讨menin蛋白对SOX4基因表达的调控作用.方法 构建包含SOX4启动子的报告基因载体,利用荧光报告基因系统分析menin对SOX4基因启动子活性的影响,运用Real-time PCR检测SOX4基因在MEN1-/-小鼠mef细胞和野生型mef细胞中的表达差异. 结果 与野生型mef细胞比较,MEN1-/-小鼠mef细胞中SOX4基因启动子活性明显升高;而在MEN1-/-小鼠mef细胞中转入MEN1基因后,SOX4基因启动子活性显著降低.SOX4基因在MEN1-/-小鼠mef细胞中的表达量是在野生型mef细胞中的2.5倍.结论 Menin蛋白可抑制SOX4基因表达.     

小鼠IDO真核表达载体的构建及其在未成熟树突状细胞中的表达

目的 构建小鼠pEGFP-N1-IDO真核表达载体并观察其在未成熟树突状细胞中的表达.方法 利用RT-PCR方法扩增小鼠IDO基因全长,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pEGFP-N1.经酶切和测序鉴定后, 用DOTAP脂质体转染法转染未成熟树突状细胞.通过G418筛选, 用倒置荧光显微镜观察转染的未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR、Western blot检测IDO的表达.结果 小鼠全长IDO基因序列正确插入pEGFP-N1载体,与GenBank中报道的序列一致,成功构建了pEGFP-N1-IDO真核表达载体,并转染未成熟树突状细胞,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和转染未成熟树突状细胞,并证明能有效表达于未成熟树突状细胞中 .     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达.经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上,且以包涵体的形式表达.通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin.Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致.纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键.体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性.     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.