SMART技术构建的辣椒疫霉菌与辣椒互作AD-cDNA文库

为了分离和克隆辣椒中疫霉菌诱导基因,以接种辣椒疫霉菌的叶片为材料,利用SMART技术构建辣椒疫霉菌与辣椒互作的双杂交c DNA文库。结果表明:该文库容量为3.6×106cfu,重组率88%左右,插入片段集中在300~2000bp之间,平均长度约为800bp,表明获得的文库质量较高,该文库将为分子育种提供重要的基因资源。     

用选择性培养基检测辣椒种子疫霉菌

在国内外疫霉菌选择性培养基配方研究的基础上,配制含有多菌灵的选择性培养基（匹马霉素10 mg、氨苄青霉素250 mg、利福平10 mg、五氯硝基苯100 mg、恶霉灵100 mg、多菌灵10 mg）,能有效地抑制镰孢菌等杂菌的生长。用此培养基成功地从贮存1、10、30、60、90、120 d的辣椒疫病种子上分离出疫霉菌,贮存120 d时分离率为2 %。     

青海省辣椒疫霉菌生理小种鉴定

以来自青海省7个主要辣椒种植区域的43株辣椒病样为试材,采用离体叶片法及形态学观察,对辣椒疫霉菌的生理小种进行划分,并研究了生理小种的分布特点。结果表明:青海省辣椒疫霉菌生理小种划分为2号和3号,没有发现1号生理小种,发生频率分别为32.6%和67.4%;初步确定3号生理小种为青海省辣椒疫霉菌的优势小种。     

辣椒疫霉菌粗毒素对叶片组织超微结构的影响

 在辣椒疫霉菌作用下, 辣椒3叶期叶组织细胞超微结构发生了显著的变化, 质膜内陷, 叶绿体膜、线粒体膜和核膜结构破坏; 细胞器基质的电子密度下降; 叶绿体基粒片层肿胀, 排列紊乱; 线粒体嵴消失, 出现空泡化。     

辣椒疫霉菌的分离纯化及室内药剂筛选

采用组织分离法对张家口市辣椒疫病病原菌进行了分离培养和形态观察,并利用菌丝生长速率法测定了7种杀菌剂对该菌的毒力.结果表明:经鉴定该菌为辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian);抑菌效果最好的是64％噁霜·锰锌可湿性粉剂500倍液,抑制率为71.38％;其次是嘧菌·百菌清悬浮剂500倍液和72％霜脲·锰锌可湿性粉剂400倍液,抑制率分别为66.89％和62.35％;抑制效果最差的是66.6％霜霉威盐酸盐水剂500倍液,抑制率为22.67％.     

疫霉菌侵染后辣椒生理生化指标研究

用辣椒疫病菌生理小种ph3人工接种抗疫病的辣椒品系A5、A3和感病品系EC,并用生理小种ph1接种抗病品系A3,接种后分别测定和分析植株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)和几丁质酶(Chitinase)活性的变化。结果表明:接种疫霉菌后,抗病品系与感病品系体内4种酶的活性有明显差异,并显示出辣椒品系的抗病性与植株体内的多酚氧化酶活性、苯丙氨酸裂解酶活性、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性呈正相关。     

辣椒疫霉菌对甲霜灵的抗性风险研究

通过对安徽省各地辣椒疫霉菌对甲霜灵抗性进行监测和室内抗性诱导, 结果发现: 野生辣椒疫霉菌株中敏感、中抗和抗性菌株分别占 63.2%、30.4% 和 6.4%, 说明敏感菌株是安徽省辣椒疫霉菌的优势种群, 但 EC50 测定结果表明安徽的辣椒疫霉菌对甲霜灵的敏感性群体水平上已出现不同程度的分化; 室内药剂直接诱变容易获得抗性突变株, 且抗性水平可较其敏感亲本高近 1 000 倍, 说明辣椒疫霉菌对甲霜灵存在较大的抗药性风险, 据此, 讨论了相应的抗药性治理对策。     

土壤中辣椒疫霉菌诱集方法的研究

比较了土壤稀释液培养法、埋茎法和叶饵诱集法检测土壤中辣椒疫霉菌的准确性和可操作性,提出了用植物叶片诱集土壤中的疫霉菌,诱集速度快,可直接判断土壤内的存活菌量,并可根据诱集的土壤菌量判断当年辣椒幼苗疫病的病情。从11种植物叶片对辣椒疫霉菌的诱集能力和检测的准确性中选出以灰绿藜叶饵的诱集效果最好,叶饵着生孢子囊量多。     

三种杀菌剂防治辣椒疫霉菌毒力测定

采用培养皿滤纸抑菌圈法测定三种杀菌剂对辣椒疫霉菌抑菌能力的大小。试验选用了７２％克露ＷＰ,５０％速克灵ＷＰ和５０％利得ＷＰ,它们的毒力回归方程分别为：ｙ克＝－３．６４５９＋２．７４４ｘ（ｒ＝０．９１４４）;ｙ速＝－３．４２２５＋２．６７２２（ｒ＝０．８８８６）;ｙ利＝－３．１８３８＋２．５０９９ｘ（ｒ＝０．８８３２）ｙ与ｘ呈正相关,其ＥＤ５０分别为１４１５．２５（１０＾－６）、１４１８．９０（１０     

不同木霉菌株对辣椒疫霉菌的防控作用

以6个不同种(Trichoderma hamatum、T.virens、T.citrinoviride、T.longibrachiatum、T.afroharzianum和T.asperelloides)的30株木霉菌株为试材,采用室内平板拮抗、温室盆栽和田间接种生防木霉菌的方法,研究了不同木霉菌对辣椒疫病的防治效果。结果表明:木霉菌对辣椒疫霉菌菌丝生长具有较好的抑制效果,不同木霉菌株间抑制率差异显著(P0.05),平板拮抗抑制率在60.00%以上的菌株占总数的70%;木霉菌株T10(T.hamatum)的防控效果显著高于其它木霉菌株,在温室接种辣椒疫霉菌30d后防控效果达到71.60%;在田间,木霉菌株T10对辣椒疫病的防治效果可达68.02%,与对照药剂烯酰吗啉的防治效果相当,且能够显著增加辣椒果实的产量,单株增产率达到14.30%,高于烯酰吗啉。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

主要果树病毒实时荧光定量PCR检测技术研究进展

综述了苹果、梨、柑橘、葡萄和香蕉病毒的实时荧光定量PCR检测技术研究进展,并对今后主要研究方向进行了讨论和展望。     

不同抗性辣椒品种根系分泌物对疫霉菌的影响

为分析辣椒根系分泌物与抗疫病的相关性,测定了4 个不同抗性辣椒品种的根系分泌物对辣椒疫霉菌的影响。结果表明：对辣椒疫病表现抗病的PRMND 和DNP56 的根系分泌物对疫霉菌的菌丝生长、游动孢子囊形成、游动孢子释放和休止孢子萌发均有显著的抑制作用,而对辣椒疫病表现高度感病的科星6 号和新机遇的根系分泌物对疫霉菌的菌丝生长没有明显影响,科星6 号根系分泌物对游动孢子囊的形成没有明显的影响,而新机遇根系分泌物对游动孢子囊形成有明显抑制作用,科星6 号和新机遇的根系分泌物对游动孢子释放和处理8 h 后对休止孢子萌发具有明显的抑制作用,但其抑制效果显著低于抗病品种。     

辣椒疫病拮抗菌的分离、筛选与评价

从67份不同土样中分离得到382株细菌、264株放线分离物,通过平板时峙培养,筛选出拮抗辣椒疫霉的株,其中放线的比例较高,为44.1%;而细菌所占比例则较低,仅为8.5%.测定了抑活性较强的26株株对6种植物病原真的拮抗作用及盆栽控病效果.试验结果表明,拮抗B-YD4-6,A-NP6-7和A-GD5-2对6种植物病原真菌均有抑作用.且抑能力较强,抑圈直径为22.0～26.0 mm,抑制率达45.18%～55.56%;且该3株拮抗株对辣椒疫病的防治效果较好,21 d后的防治效果分别为65.5%,67.4%,64.5%.     

8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法进行了8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)的毒力测定。结果表明,供试8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌菌丝生长和孢子萌发均具有一定的抑制效果,其中1%申嗪霉素悬乳剂对南瓜疫病菌菌丝生长的抑制作用最强,2%宁南霉素次之,5%井冈霉素水剂最弱。     

百合疫病病原鉴定及其PCR检测

 对从百合疫病病株上分离得到的病原菌进行了形态特征观察、致病性测定及核糖体DNA-ITS序列分析。结果表明,该菌为疫霉属真菌,与GenBank中烟草疫霉ITS序列的同源性为98% ~ 99%。结合病原菌PCR检测结果,进一步证实其为烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。这是烟草疫霉菌侵染云南切花百合的首次报道。     

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g^-1;检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g^-1。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

利用实时荧光PCR 方法检测香蕉软腐细菌

 由Dickeya spp.引起的香蕉细菌性软腐病是近年来在中国广东发生的一种严重危害香蕉的病 害,检测方法的建立和应用是防止病害传播和实时防治的重要手段。依据报道的Dickeya spp.通用引物, 建立了用于香蕉细菌性软腐病发病植株和带菌土壤检测的实时荧光PCR 方法。优化后的检测体系对香蕉 软腐细菌（XJ8-3-3）靶片段克隆质粒DNA 的检测灵敏度可达到2.4 × 10^-5 ng · μL^-1,对菌悬液的检测灵敏 度可达到4.0 × 10² cfu · mL^-1,而常规PCR 对其检测的灵敏度为2.4 × 10^-3 ng · μL^-1 和4.0 × 10⁴ cfu · mL^-1, 实时荧光PCR 的灵敏度比常规PCR 高100 倍。利用实时荧光PCR 能够快速的检出香蕉细菌性软腐病发 病植株和带菌土壤中的病原菌量,对梯度稀释的菌悬液接种的带菌土壤检测结果表明,可检测到病菌DNA 最低含量为0.35 pg · L^-1。该方法适用于对香蕉软腐病菌的检测和监控。     

葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系,扩增效率为99.2%,决定系数为0.999,可特异性检测GVA,灵敏度高（达常规RT-PCR的100倍）,重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条）中GVA的检出率普遍高于常规RT-PCR。不同季节间比较,对秋、冬季样品检测效果最好,除嫩叶外其余部位检出率均达100%,春夏季检出率为10% ~ 100%。不同部位间比较,老叶柄和休眠枝条检测效果最好,检出率均达100%,其次为老叶（80% ~ 100%）,其余部位样品检出率为10% ~ 100%。在大量田间样品检测中,休眠枝条样品检测结果与常规RT-PCR一致,而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规RT-PCR。