胶质瘤组织实时定量 PCR 检测中内参基因的选择

目的筛选胶质瘤组织中表达稳定性高的内参基因,为胶质瘤基因表达研究选取合适的内参基因提供实验基础。方法以相对正常脑组织及胶质瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组织共25例为实验对象,利用Real-time PCR技术对15个候选内参基因进行筛选,通过geNorm软件对实验结果进行数据分析。结果在15个内参基因中,GUSB、ACTB、TBP、GAPDH、ATP5F1和PPIA 6个基因表达稳定,平均表达稳定度（ M值）均＜0.5,其中ATP5F1和PPIA为表达最稳定的两个内参基因,其M值为0.26。标准化因子V2/3＝0.102,小于取舍值0.15。结论在胶质瘤组织实时定量PCR分析中,ATP5F1和PPIA2个内参基因联合使用,可较好地共同校正基因表达结果。     

如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因?

答:随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法,基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用.采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围,理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达.管家基因是维持细胞最低限度功能不可少的基因,在所有类型细胞中都表达,是广泛应用的内参基因.但是,很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定,甚至差别很大,至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因.因此,对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价,筛选出最为稳定的管家基因作为内参基因,对保证研究结果的真实、可靠至关重要.     

荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血 WT1基因表达及其临床意义

为研究WT1基因表达与临床疗效和预后的关系,探讨其在白血病微小残留病检测中的作用,用荧光定量RT-PCR方法检测55例初发白血病患者外周血及10例正常人外周血的WT1基因表达,跟踪20例急性白血病患者外周血WT1基因表达。结果显示,白血病初治组(40例ANLL、15例ALL)与正常人外周血WT1基因表达有显著差异(P<0.001)。在急性白血病患者中,WT1≤6.8×10-3组生存期长于WT1>6.8×10-3组(P=0.027);白血病患者初发时WT1呈高度表达,完全缓解后,迅速或缓慢下降至少1个对数级,复发时再次增高。跟踪检测20例急性白血病患者外周血WT1基因表达,结果7例复发,5例在临床复发前2-3月WT1的水平明显增高,至少上升0.8个对数级。结论:荧光定量RT-PCR方法检测白血病外周血WT1表达具有简便易行、准确性高、特异性好的特点。与正常人外周血比较,WT1在各类白血病外周血中呈高度表达,且表达水平与预后负相关;对外周血WT1基因表达进行定量分析,可用于微小残留病的监测。     

Hoehn-Yahr分级为1期的帕金森病患者外周血 基因差异表达分析

目的:对Hoehn-Yahr分级为1期的帕金森病(PD)患者外周血进行基因芯片研究,分析PD患者外周血基因表达的变化。方法:从GEO数据库中获得Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因数据集GSE54536。运用GEO2R筛选差异表达基因,DAVID工具进行富集基因功能和通路分析。STRING数据库构建差异表达基因蛋白相互作用的网络,应用Cyto Scape软件筛选核心基因。结果:共筛选到997个差异基因,涉及细胞间信号转导、细胞分泌等生物学过程及PI3K-Akt等信号通路。c-fos、KDM6B、ESR1等为核心基因。结论:通过对Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血的基因芯片进行研究,提示PD为多种基因,多种分子机制相互作用的结果,对相关分子机制的研究有助于进一步阐明PD患者的发病机制。     

动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞ABCA1基因表达及其临床意义

目的探讨动脉粥样硬化(AS)患者外周血单个核细胞(PBMCs)ABCA1基因表达及其与疾病发生、发展的关系。方法收集本院50例AS患者和45例健康对照者标本,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血单个核细胞(PBMCs)ABCA1基因mRNA表达,RT-PCR反应后产物进行电泳,用紫外透射仪观看结果并拍照,最后得出ABCA1相对含量值。结果 AS患者PBMCs中ABCA1基因mRNA表达均明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 ABCA1基因表达与AS发生发展息息相关,在AS的发病过程中起重要作用,为研究ABCA1基因在免疫炎症的发生与其在动脉粥样硬化的过程中发挥的诱导机制提供了新依据。     

基于GEO 数据库筛选稳定性心绞痛患者外周血关键差异基因及诊断模型构建

目的 通过生物信息学方法对稳定性心绞痛患者外周血基因表达谱芯片进行分析,获取其外周血表达谱特征并筛选关键差异表达基因作为潜在的分子标记物并构建Nomogram 诊断模型。方法 从NCBI 中的基因表达综合(GeneExpression Omnibus,GEO)数据库中下载稳定性心绞痛患者和对照组的外周血基因表达谱芯片数据集GSE98583,使用R 软件limma 包筛选出具有显著意义的差异基因(differential expression genes,DEGs);利用clusterProfiler 包进行基因本体(gene ontology,GO) 与KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes) 通路富集分析;使用STRING 在线分析工具构建蛋白交互网络和Cytoscape 软件Cytohubba 和Mcode 插件筛选出关键基因;以关键基因为变量构建稳定性心绞痛Nomogram 分子诊断预测模型。结果 通过比较稳定性心绞痛患者和正常受试者外周血基因表达谱,共筛选出303 个差异表达基因,其中上调基因160 条,下调基因43 条;GO 和KEGG 分析表明,这些差异表达基因主要参与神经递质配体受体相互作用、脂肪吸收消化、钙调节信号通路、PI3K-Akt 通路、NF-kappaB 通路及氧化磷酸化等有关,使用Cytohubba 进一步分析,筛选出10 个关键基因BDNF, GFAP, SYN1, NES, PLG, HPGDS, KCNC1, APOA4, AMBP 和TJP1,并建立了Nomogram 诊断模型。结论 使用生物信息学方法揭示稳定性心绞痛外周血差异基因潜在特征,为稳定性心绞痛的早期诊断提供新的思路。     

荧光定量聚合酶链反应法比较标准管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠不同组织中的表达

背景:反转录聚合酶链反应用于基因表达分析越来越显示出其重要性,其中合适的内参基因选择很重要,目前并没有适合于所有体系可作为内参的管家基因.人鼠是常用动物模型,选择合适的大鼠管家基因作为内参尤其必要.目的:比较分析使用最广泛的4个标准管家摹因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠肝、肾、心、肺组织和大脑皮质中的表达情况.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-07/08在泰山医学院生命科学研究所分子生物学实验室及泰安市疾控中心病毒检测中心实验室完成.材料:选用老年SD大鼠3只,用于检测管家基因表达情况.方法:采用反转录实时荧光聚合酶链反应技术检测老年大鼠肝、肾,心、肺组织和大脑皮质中有着不同表达丰度和功能的4个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA的表达情况.主要观察指标:老年大鼠不同组织内4个管家基因的表达水平及不同组织间的表达差异.结果:①酸性核糖体磷蛋白P0在老年大鼠不同组织间表达差异最小.②老年大鼠肾组织中表达最稳定的管家基因是β-肌动蛋白:心脏组织和肺组织中表达最稳定的管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶.结论:老年大鼠组织间信使RNA分析仅用1个内参基因是不合适的,至少应该使用两个参照基因,1个选用18S核糖体RNA:另一个基因的选择标准如下:适用于分析不同组织间基因表达情况的内参基因是酸性核糖体磷蛋白P0,而心脏和肺组织研究适用3-磷酸廿油醛脱氢酶,肾组织研究适用β-肌动蛋白.     

应用实时RT-PCR技术的mRNA定量分析

1　ｍＲＮＡ定量的意义特定基因的表达水平可反映细胞的生长、存活状态 ,对特定基因转录水平的定量分析已成为基因功能研究的核心部分[1] 。最近 ,分子生物学技术的飞速发展使得ｍＲＮＡ定量分析用于临床诊断成为现实 ,其应用涉及面很广 ,包括检测肿瘤细胞耐药基因的调节与表达、化疗疗效的分析、基因治疗的生物动力学与转录、表达水平的研究 ;并提供了评价肿瘤进展 ,检测外周血中肿瘤细胞的有效手段 ;此外 ,ＲＮＡ定量分析还可用于病菌、病毒的检测[2～ 6 ] 。通常用于ｍＲＮＡ定量分析的方法有 :①Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交、原位杂交 +后续…     

大鼠原代脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/复氧模型中内参基因的选择

目的筛选大鼠原代脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型中合适的内参基因。方法实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3种常用管家基因:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、核糖体蛋白L13A(RPL13A)在大鼠原代脑微血管内皮细胞中的表达水平;并采用Ge Norm程序分析得到最稳定的内参基因。结果 RPL13A、GAPDH、ACTB基因表达稳定度的平均值(M值)分别为0.590、0.570、0.397。结论在大鼠原代脑微血管内皮细胞OGD/R模型中表达最不稳定的内参基因是RPL13A,最稳定内参基因是ACTB。     

白血病细胞WT1基因启动子区DNA甲基化研究

目的：研究白血病细胞WT1启动子区DNA甲基化与其表达的关系。方法：采用RT-PCR技术、硫化PCR结合限制性内切酶技术检测白血病细胞系及正常人外周血单个核细胞WT1基因的表达及其启动子区DNA甲基化水平。结果：正常人外周血单个核细胞及U937细胞不表达WT1基因，而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因，HL-60细胞WT1基因无甲基化。结论：WT1基因启动子区DNA甲基化不能抑制其表达，尚存在其他调节WT1基因表达的因素。     

急性缺血性卒中相关基因的筛选和验证

目的:通过分析基因表达谱,探讨缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)的分子机制和诊断标志物。方法:下载GEO数据库中缺血性卒中患者和对照组的基因芯片数据,使用Pubmed提供的GEO2R软件和R语言筛选出具有显著意义的差异基因(differential genes,DEGs);利用Metascape进行基因本体(gene ontology,GO)与酶和通路数据库(Reactome)基因集分析;使用STRING在线分析工具和Cytoscape软件分析出关键基因;最后,收集急性卒中患者外周血,通过RT-PCR进行验证。结果:通过分析IS患者外周血基因芯片数据集,共筛选出20个差异表达基因;基因注释和信号途径分析表明,这些差异表达基因主要参与中性粒细胞脱颗粒、对外来生物刺激反应、细胞因子生产、有机阴离子运输、对脂肪酸的反应和中性粒细胞迁移等。使用Cytoscape和MCODE插件进一步分析,筛选出5个关键基因(MMP-9,OLFM4,ORM1,FOLR3和ARG1);RT-PCR证实ARG1和MMP9 mRNA在IS患者外周血中过表达。结论:缺血性卒中伴随多个基因表达异常,本研究为探索IS的发病机制和开发新的诊治疗策略提供了线索。     

NAT1、CXCL9、BPI和HLA-DQB1在溃疡性结肠炎中的表达

目的:通过检测寡聚核苷酸芯片结果中表达上调的BPI、CXCL9、NAT1和下调的HLA-DQB1以提高基因芯片的可信度,同时为UC的发病机制、病因诊断及基因治疗的靶点提供一定的依据.方法:采用半定量RT-PCR技术检测这四个基因在21例溃疡性结肠炎(UC)组和21例正常组外周血中的相对表达量.结果:NATI、BPI和CXCL9在UC组表达水平较正常组高,差异有统计学意义(P<0.05),与基因芯片结果吻合;HLA-DQBI在UC组中较正常组中表达上调,与基因芯片结果不相吻合.结论:基因芯片和RT-PCR分析基因表达变化都是可信的,它们在基因表达谱分析、易感基因的筛选研究等都具有极其重要的作用.     

干燥综合征患者白细胞跨内皮细胞转运途径和细胞粘附分子途径相关基因表达

目的分析干燥综合征患者白细胞跨内皮细胞转运及细胞黏附分子途径相关基因的表达情况及其意义。方法取3例干燥综合征患者及3例正常对照者的外周血单个核细胞,提取总RNA,反转录至cDNA后与寡核苷酸芯片杂交。采用图像分析软件对芯片图像进行数据提取,以Cy5/Cy3的比值数据分析处理。结果干燥综合征组与对照组外周血单个核细胞中的白细胞跨内皮细胞转运途径及细胞黏附分子途径相关基因表达差异最为显著(P<0.01),以上途径中VCAM1、PECAM1、ICAM1、ITGAL、SELE这5个基因表达上调,JAM1、JAM2、JAM3、SELL、CD226、CD99这6个基因表达下调。结论干燥综合征患者在白细胞跨内皮细胞转运途径及细胞黏附分子途径相关基因的表达差异最为显著,这些基因将为研究疾病的发病机制及新的治疗靶向提供重要依据。     

慢性髓细胞白血病增殖细胞核抗原基因的异常表达

目的 了解慢性髓细胞白血病（CML）基因表达谱规律,对在CML中高表达的PCNA基因进行分析鉴定.方法 应用基因表达谱芯片技术,对CML患者和正常人的外周血单个核细胞（PBMC）基因表达差异进行分析.对于其中表达显著上调的增殖细胞核抗原（PCNA）基因,根据其核苷酸序列设计并合成该基因序列特异性引物,以CML PBMC的总RNA为模板,RTPCR技术扩增PCNA基因;用蛋白印迹法分析PCNA蛋白的表达.结果 从4 096个基因中筛选出差异表达基因共591奈,其中288条基因表达增强,303条基因表达降低.在表达增高的基因中,PCNA表达增高8.725倍.在病人的标本中扩增出PCNA基因,蛋白印迹证明CML病人PCNA蛋白表达增高.结论 基因表达谱芯片检测发现CML中PCNA基因高表达,并在mRNA转录水平及蛋白表达水平证明其异常表达,提示PCNA的表达增高与CML的发病存在一定的关系.     

卵巢特异启动子调控白介素24基因真核表达载体的构建

目的构建卵巢特异启动子-1（ovarian-specific promoter,OSP-1）调控白介素-24基因（Interleukin-24,IL-24）表达的真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血基因组中扩增IL-24基因片段,应用基因重组技术将0SP-1启动子片段插入到pcDNA3.0真核表达载体,替换pcDNA3.0载体的CMV启动子与增强子序列,然后将克隆的IL-24基因片段插入到pcDNA3.0-OSP-1载体的OSP-1启动子的下游,从而构建成由OSP-1启动子调控IL-24基因表达的载体pcD-NA3.0-OSP-1-IL-24。结果载体构建过程的酶切结果以及测序结果表明载体pcDNA3.0-OSP-1-IL-24构建正确。结论通过基因重组技术成功构建了卵巢特异启动子调控IL-24基因表达的真核表达载体,为体外研究IL-24靶向特异性杀伤卵巢癌细胞提供了前期实验基础。     

子痫前期外周血免疫相关基因的差异表达

目的 了解子痫前期患者外周血免疫相关基因的差异表达,探索其与子痫前期发病的关系。方法选择4例重度子痫前期患者为研究对象,以4例正常妊娠妇女为对照,应用基因芯片技术检测两组孕妇外周血差异基因表达谱,了解子痫前期外周血免疫相关基因的异常表达。结果在所检测的21000个基因中,出现2次重复一致差异表达的免疫相关基因共有33个,子痫前期组差异表达上调基因23个,下调基因10个。结论免疫相关基因的差异表达可能是子痫前期发病的原因之一。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞IL-23p19表达增高及意义

目的 研究IL-23p19在原发性胆汁性肝硬化(PBC)外周血单个核细胞中的表达及意义。方法 采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了60例PBC患者及60例疾病对照和60例健康对照外周血单个核细胞(PBMC)中IL-23p19基因表达量,应用统计学软件分析PBC IL-23p19基因表达与疾病分期及肝功能指标间的相关性。结果 PBC患者外周血PBMC中IL-23p19基因表达较健康对照和疾病对照均明显增高,且在疾病的I/II期表达高于III/IV期; IL-23p19表达与谷氨酰转肽酶(GGT)正相关。结论 IL-23p19基因在PBC中表达升高,通过促炎反应参与PBC发病。     

应用基因芯片技术检测中国成年肥胖者外周血的基因表达谱

背景:肥胖是全世界最常见、花费最大的代谢性疾病,基因及环境因素已经成为肥胖研究的焦点因素之一,基因芯片技术已被用于脂肪组织的研究.目的:采用基因芯片技术,首次测定中国成年肥胖者的外周血基因表达谱.设计:对照观察.单位:北京中医药大学.对象:由北京中医药大学基础医学院于2003-0812004-05组织,按国际体质量标准在北京市工人疗养院筛选5例肥胖者和3例体质量正常者.5例肥胖者中男4例,女1例,年龄(21±1)岁;3例体质量正常者中男2例,女1例,年龄(26±5)岁.所有受试人员对实验方案均知情同意,且得到医院伦理道德委员会批准.方法:取上述受试者的外周血,提取总RNA并进行扩增和标记,用Test3芯片检测受试样品的质量,用U133A芯片进行基因表达谱观察,并将所得数据进行统计学分析,从基因BANK中查出具有显著差异的序列所标志的基因.主要观察指标:基因表达信号值.结果:与体质量正常者相比,肥胖者外周血基因表达谱显著上调的基因有66个,显著下调的基因有28个;其中上调超过2倍的有11个,下调超过2倍的有6个.肥胖者表达上调超过4倍的基因为HLA-DQAl,CRAT,MAPK813和DKFzP434N1923.其中表达上调超过20倍的基因为HLA-DQAI.结论:首次发现肥胖成人的外周血相关基因表达与体质量正常者有明显差异,肥胖与MHC Ⅱ类抗原HLA-DQAl,HLA-DQBl表达密切相关.     

应用实时荧光定量PCR技术检测外周血白细胞分子标志物评估胰岛素敏感性的研究

[目的]通过建立实时荧光定量PCR技术检测外周白细胞中mRNA基因表达差异的方法来评定或预测胰岛素抵抗的发生，以期了解其在2型糖尿病发生中所发挥的作用。[方法]应用实时荧光定量PCR技术检测中国北方居民，年龄、性别相匹配的胰岛素抵抗者和胰岛素敏感者外周血白细胞mRNA基因表达水平，根据候选基因（未知序列）的mRNA表达浓度差异。了解胰岛素抵抗的发生情况。[结果]（1）建立由外周血提取RNA，并逆转录为cDNA的方法；（2）应用实时荧光定量PCR技术检测候选基因；（3）初步了解两组人群外周白细胞mRNA特异性表达的差异。[结论]应用β-actin作为管家基因建立较稳定的实时定量PCR方法能够应用于分子流行病学分析。候选基因在不同人群的表达差异表明可能做为早期预测胰岛素抵抗的一种基因。     

外周血中血凝素样氧化低密度脂蛋白受体蛋白表达与冠心病相关性研究

目的研究外周血中血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）蛋白表达与冠心病的相关性。方法以不同类型冠心病患者外周血淋巴细胞和单核细胞为研究对象，冠心病危险人群和正常体检人群作为对照组，采用免疫印迹技术检测冠心病患者外周血淋巴细胞和单核细胞LOX-1蛋白表达水平。结果冠心病组LOX-1蛋白表达高于冠心病危险人群组，体检健康人群无或有低LOX-1表达，与冠心病组相比差异有统计学意义（P〈0.01）。冠心病组中单纯心绞痛患者LOX-1表达低于心肌梗死、合并心力衰竭、合并心律失常患者，LOX-1表达水平与患者年龄、性别无相关性。危险人群中以高血脂者LOX-1蛋白表达最高，糖尿病患者与高血压患者次之，以上人群表达均高于正常人群。结论外周血淋巴单核细胞中LOX-1蛋白的异常高表达与冠心病发生相关，可提示有潜在的合并症发生，LOX-1蛋白表达水平与冠心病患者年龄、性别等无关。检测外周血淋巴细胞和单核细胞LOX-l表达水平有可能作为临床上预测冠心病的方法之一。