miR-429在低氧环境中对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探讨在低氧环境中,miR-429对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 在体内、外用氯化钴(CoCl₂)模拟低氧环境,采用免疫蛋白印迹(western blot, WB)检测低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1α的表达验证低氧情况,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)观察骨折部位及细胞组织中miR-429的表达情况,同时检测MC3T3-E1细胞在低氧状态下的增殖与凋亡情况;通过慢病毒转染技术在MC3T3-E1细胞中过表达miR-429作为实验组,对照组为转染空载质粒细胞,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测、茜素红染色、WB等方法观察细胞中ALP活性、矿物质含量以及多种成骨标志物蛋白表达情况,对比两组MC3T3-E1细胞的成骨分化;在骨折模型局部注射过表达miR-429的慢病毒载体,通过Micro-CT及qRT-PCR观察骨折愈合情况。结果 在低氧环境MC3T3-...     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化

目的探讨miR-137对RUNX2的靶向作用及其对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法通过软件预测miR-137与成骨标志基因RUNX2的结合位点。检测MC3T3-E1细胞诱导成骨分化过程中miR-137的表达变化。转染miR-137 mimics或miR-137 inhibitor后,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,检测成骨分化标志物(RUNX2、ALP、OPN、OCN及OSX)表达变化。结果经软件预测,miR-137与靶基因RUNX2有结合位点。MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,miR-137表达下调。转染miR-137mimics的MC3T3-E1细胞成骨标志基因表达受到抑制,而转染miR-137 inhibitor组成骨标志基因呈不同程度表达上调。结论miR-137通过靶向作用RUNX2基因调控MC3T3-E1细胞成骨分化。     

Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力影响的实验研究

目的 探讨Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响,并初筛其下游的靶基因.方法 将多个成骨诱导因子作用于MC3T3-E1细胞,明确Foxc2的表达.采用慢病毒plenti-Foxc2及plenti-EGFP转染MC3T3-E1细胞,构建MC3T3-E1Foxc2+及MC3T3-E1EGFP.检测细胞增殖、细胞...     

THSD4基因在小鼠间充质干细胞及MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用

目的 探讨THSD4基因对小鼠间充质干细胞和MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 提取绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞进行基因测序分析,与骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞进行比较,分析基因表达差异。通过提取不同分化阶段的小鼠骨髓间充质干细胞（M-BMSC）及MC3T3-E1细胞的mRNA来检测THSD4 基因以及成骨分化的标志性基因（ALP、Runx2、Osx）的表达水平。通过构建慢病毒表达载体来实现对M-BMSC及MC3T3-E1细胞中THSD4的敲减及过表达,并观察其对M-BMSC及MC3T3-E1细胞成骨分化能力的影响。结果 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且通过KEGG以及GO富集分析发现THSD4基因可能与PI3K-AKT信号通路及Wnt信号通路相关。随着成骨诱导分化时间的延长,THSD4 mRNA和成骨分化标志性基因（ALP、Runx2、Osx）mRNA在MC3T3-E1以及M-BMSC中表达量均逐渐增加。过表达THSD4可以增强MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力,而敲减THSD4则减弱了MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力。结论 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且THSD4基因可以增强MC3T3-E1细胞以及M-BMSC的成骨分化能力。     

MicroRNA-196a靶向调节HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探究微小RNA（miR）-196a靶向调节组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组（Cont）组、诱导组、miR-196a-mimics-NC组、miR-196a-mimics组、miR-196a-inhibitor-NC组、miR-196a-inhibitor组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组,根据分组转染后进行成骨诱导。定量荧光PCR检测MC3T3-E1细胞中miR-196a、HDAC9表达量;试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化程度;Western blot检测HDAC9、ALP、Runt相关转录因子2（Runx2）、胶原蛋白I（COL1）、骨桥蛋白（OPN）、Histone H3、Histone H3（acetyl K9、K14和K23）表达量。结果 与Cont组相比,诱导组MC3T3-E1细胞中miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3 K9、K14、K23位点乙酰化水平增高（P＜0.05）,HDAC9 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。转染miR-196a-mimics可明显增加miR-196a表达,降低HDAC9表达,并增加ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3乙酰化,转染miR-196a-inhibitor则作用相反。miR-196a可靶向下调HDAC9表达,过表达HDAC9可部分逆转miR-196a mimics对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进效应。结论 miR-196a可靶向下调HDAC9表达,增加组蛋白乙酰化水平,促进MC3T3-E1细胞成骨分化。     

氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖与成骨分化的影响

目的 检测氟离子植入猪骨来源羟基磷灰石（PHA）对小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）黏附、 增殖及成骨分化的影响。方法 取猪骨松质用高温烧结的方法制备PHA,使用氟化钠浸泡结合二次高温 烧结进行氟离子植入,制备获得氟化猪骨源羟基磷灰石（FPHA）骨块,进行研磨获得颗粒材料后制备 压片,采用PHA颗粒制备的压片为对照组,采用FPHA颗粒制备的压片为实验组。在压片材料表面接种 小鼠MC3T3-E1前成骨细胞株,通过扫描电镜SEM观察不同时间细胞黏附形态,CCK-8法检测细胞增 殖情况,RT-PCR法检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶ALP、骨钙素BGLAP、骨桥蛋白OPN mRNA 的表达情况。结果 扫描电镜SEM观察可见,PHA与FPHA组细胞黏附生长良好;两组细胞接种1、7d 后OD值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;FPHA组接种3、5 d后OD值高于PHA组,差异有统计学 意义（P＜0.05）;RT-PCR结果显示,FPHA组细胞接种3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表达水平均高于 PHA组,且两组细胞接种7 d后材料表面细胞ALP与BGLAP mRNA表达水平均高于细胞接种3 d后,差异 有统计学意义（P＜0.05）。结论 PHA与FPHA材料均具有良好的细胞相容性,氟离子植入猪骨羟基磷灰 石可促进小鼠前成骨细胞早期增殖与成骨分化。     

miR-381-3p通过靶向ERK1/2/ETS1信号通路影响MC3T3-E1细胞成骨分化

目的 探讨miR-381-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响和作用机制。方法 慢病毒转染细胞后实验分为NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组、NC inhibitor miR-381-3p组和inhibitor miR-381-3p组;运用实时荧光定量PCR(qR T-PCR)法检测不同组miR-381-3p的表达水平以验证转染效率;诱导MC3T3-E1细胞成骨分化后,检测各组细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性水平;茜素红染色法检测各组细胞的成骨矿化能力; qR T-PCR测定各组细胞中ALP、Runx2、PPARγ和ETS1 mR NA表达水平;蛋白免疫印迹法测定各组细胞中collagenⅠ、ALP、Runx2、PPARγ、ETS1、P-ERK1/2水平;并用MAPK/ERK通路抑制剂(PD98059)干预各组细胞后进行目的蛋白检测。结果 与NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组及NC inhibitor miR-381-3p组比较,inhibitor miR-381-3p组中细胞中ALP、Runx2、ET...     

二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞增殖和分化的影响

目的 :探讨低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、成骨分化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:将MC3T3-E1细胞接种到培养板24h后,实验组培养基中分别加入50μM(50μM组)和200μM(200μM组)的DMOG,对照组加入完全培养液。分别于培养1、3、5d时采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,5、10d行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测成骨细胞分化,21d用茜素红染色检测MC3T3-E1细胞钙结节的形成并进行定量分析,采用ELISA法检测MC3T3-E1培养3d情况时上清液中的VEGF蛋白含量,并用实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞VEGF mRNA的相对表达量。结果:培养1d时对照组、50μM组和200μM组的MC3T3-E1的光密度(optical density,OD)值分别为0.041±0.009、0.074±0.019、0.086±0.044,3d时分别为0.123±0.027、0.148±0.020、0.224±0.061,5d时分别为0.297±0.044、0.325±0.084、0.354±0.038,1d、3d时50μM组和200μM组与同时间点对照组比较均有显著性差异(P0.05),3d时50μM组与200μM组有显著性差异(P0.05)。培养5d和10d时对照组ALP染色颜色较深,50μM组颜色中等,200μM组颜色较浅;5d时对照组ALP活性为1.943±0.072,50μM组为1.632±0.051,200μM组为1.319±0.065;10d时对照组ALP活性为3.734±0.067,50μM组为3.381±0.070,200μM组为2.831±0.086。三组间同时间点比较均有统计学差异(P0.05),同组10d时与5d时比较均有统计学差异(P0.05)。茜素红染色200μM组可见少量红色结节,50μM组可见中等量红色结节,对照组可见大量红色结节;对照组茜素红含量(μg/ml)为56.178±7.940,50μM组为41.922±2.438,200μM组为31.929±1.922,三组间比较均有统计学差异(P0.05)。培养3d时对照组细胞培养上清液中VEGF蛋白含量(ng/孔)为9.063±0.603,50μM组为12.123±0.870,200μM组为15.540±0.581,三组间比较均有统计学差异(P0.05);50μM组VEGF mRNA表达量为对照组的1.792±0.067,200μM组为对照组的3.963±0.092,三组间比较均有统计学差异(P0.05)。结论 :低氧模拟剂DMOG可促进MC3T3-E1细胞增殖和VEGF表达,抑制其成骨分化。     

黄芩素通过BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨作用的实验研究

目的 探讨黄芩素（BAI）对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）成骨分化的作用及其分子机制。方法 将MC3T3-E1分为对照组（正常培养）和BAI组（以Baicalein处理）,在成骨分化条件培养下采用CCK-8检测BAI对MC3T3-E1细胞增殖的影响;分别以碱性磷酸酶染色（ALP）、茜素红染色（ARS）检测MC3T3-E1细胞成骨分化水平与矿化能力,实时荧光定量PCR检测成骨标志基因ALP、COL1A1、RUNX2、OSX的mRNA表达水平,通过免疫印迹法（Western-blot）检测MC3T3-E1细胞中BMP-2、Smad1、p-Smad1蛋白表达水平,通过免疫荧光技术（IF）检测RUNX2、COL1A1表达水平。结果 与对照组比较,BAI干预1 d后发现,BAI组COL1A1（P<0.001）、RUNX2（P <0.05）、OSX（P <0.05） mRNA表达水平在成骨分化中表达上升;干预3 d后发现,与对照组比较,BAI组ALP（P <0.05）、RUNX2（P <0.001）mRNA表达上升;干预7 d后发现,与对照组比较,BAI组COL1A1（P <0.05）mRNA表达水平较对照组上升,BMP-2、p-Smad1/Smad1蛋白表达水平上升（P <0.05）。免疫荧光中成骨标志蛋白RUNX2、COL1A1表达增多（P <0.05）。结论 BAI可通过激活BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨分化。     

组蛋白甲基转移酶2（SMYD2）抑制剂LLY-507对成骨分化的影响

目的 研究SMYD2抑制剂LLY-507对小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1）及人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的影响。方法 通过CCK-8法检测LLY-507对MC3T3-E1和hMSCs增殖的影响;采用碱性磷酸酶( ALP) 染色和活性测定检测不同浓度LLY-507干预下MC3T3-E1和hMSCs早期成骨分化标志物ALP的活性情况;通过茜素红染色及半定量分析检测LLY-507对MC3T3-E1和hMSCs矿化能力的影响;运用荧光定量PCR检测hMSCs的成骨相关基因Osterix、Runx2、OPG、OPN mRNA的表达;Western blot检测hMSCs的Runx2和SMYD2蛋白表达量。结果 CCK-8结果表明LLY-507在0.8 μmol/L的剂量下细胞活性无明显影响,不会明显抑制细胞增殖。ALP染色及活性测定表明,加入50 nmol/L及以上剂量的LLY-507干预7 d后能够明显抑制MC3T3-E1及hMSCs成骨分化以及碱性磷酸酶的表达（P<0.05）;茜素红染色及半定量分析表明100 nmol/L剂量的LLY-507能够明显抑制MC3T3-E1及hMSCs的矿化能力（P<0.05）。通过qPCR,加入25 nmol/L及以上剂量的LLY-507分别干预7 d和14 d后能够明显抑制hMSCs成骨分化相关基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表达（P<0.05）。通过Western blot, 加入50 nmol/L及以上剂量的LLY-507干预7 d和14 d后均能够明显抑制hMSCs的Runx2蛋白和SMYD2蛋白的表达。结论 抑制SMYD2的表达能够抑制成骨相关基因的表达,说明SMYD2在成骨分化过程中起到促进成骨的作用。     

唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞体外增殖和成骨分化的影响。方法将小鼠胚胎成骨细胞体外传代培养,使用含不同浓度（1.0、0.1μmol/L）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞,不含唑来膦酸的培养基作对照,培养1、3、5 d采用CCK-8试剂盒检测唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响;培养14 d行碱性磷酸酶（ALP）染色;培养21 d行茜素红染色;培养7 d,实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测转录因子Runx2、成骨标志物Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ）、ALP、骨钙素（OCN）基因的表达,免疫印迹法（Western Blotting）检测转录因子Runx2蛋白的表达。结果不同浓度的唑来膦酸干预细胞后,CCK-8实验检测吸光度值随天数增加而升高,各组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。随着唑来膦酸浓度的升高,ALP染色和茜素红染色逐渐变浅,Runx2、Collagen TypeⅠ、ALP、OCN基因的表达量降低,Runx2蛋白的表达量降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论唑来膦酸在选定浓度（1.0、0.1μmol/L）下不影响成骨细胞的增殖,但对其分化功能的抑制作用随着浓度的增加而增强。