细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体制备

为建立抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体细胞株，采用经口感染狗肠壁上寄生的成虫制备抗原免疫BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤sp2／0进行细胞融合。结果显示经筛选克隆后建立了一株分泌抗成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2G5E8F4E4。腹水的抗体效价为1：12800。初步建立了分泌抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

分泌抗细粒棘球绦虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为了对包虫病的免疫诊断和免疫预防提供有价值的单克隆抗体,通过对骨髓瘤细胞SP2/0与用细粒棘球蚴囊液免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合试验及多次筛选、克隆,建立了分泌单克降抗体的细胞株NIA_2。用ELISA及免疫电镜等方法检测证实该细胞株有特异性。其培养上清分泌抗体滴度为1:2560,注入同系小鼠腹腔,诱生肿瘤和滴度为1:163840的腹水。免疫球蛋白鉴定表明是IgG_1,未见对囊虫的阳性反应。该杂交瘤细胞株经组织培养传代10个月,分泌抗细粒棘球绦虫抗体性能稳定。     

分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用棘球蚴囊壁生发展制备抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与骨髓瘤ＳＰ２／Ｏ进行细胞融合，经多次筛选克隆后建立了分泌抗细粒棘球蚴单克隆抗体细胞株Ｃ５Ｆ２Ｃ１１Ａ１１，Ｃ１２Ｃ１１Ｆ６Ｇ３，Ｃ１２Ｈ１２Ｆ８Ｄ５三株。应用ＥＬＩＳＡ及免疫组化法检测该三株具有特异性，培养上清分泌抗体滴度分别为１：２５６０，１：５１２０，１：５１２０。     

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。     

新疆北部骆驼源细粒棘球绦虫成虫扫描电镜观察

从新疆北部地区感染囊型包虫病的骆驼肝，肺包囊中收取细粒棘球蚴原头节，实验感染家犬后，分别于第３５天和第４５天收集成虫进行扫描电镜观察。骆驼源细粒棘球绦虫成虫的外部形态特点；整个虫体表面被覆着微毛，与其他来源的成虫相比其微毛相对浓密柔细，成熟体节的生殖孔有两种不同的形态；有雄茎伸出的生殖孔凹陷不明显，孔周区没有感觉乳头出现，在雄茎表面密布丝状微绒毛，没有雄茎伸出的生殖孔凹陷明显，孔周区有许多大小不等     

青海不同株细粒棘球绦虫成虫的超微结构研究

运用透射电镜和扫描电镜分别观察了青岛海高原牦牛和藏羊源原头蚴感染犬后细粒棘球绦虫成虫的超微结构。结果表明两源细粒棘球绦虫成虫的表面结构和皮层结构相似。这些形态结构特点与文献报道明显不同，提示青海高原存在不同株的细粒棘球绦虫。     

Lack of interspecies barriers in anti–Id stimulated antibody production against Echinococcus granulosus antigens

Polyclonal human anti-hydatid antibodies were affinity purified from a hydatid patient serum and used to produce a rabbit anti-idiotypic serum. These anti-Id antibodies cross-reacted in ELISA with sera from 11 of 12 hydatid patients studied and with 13 infected or immunized mice sera. All mice primed and boosted with anti-Id produced anti-hydatid antibodies in the primary response and exhibited an increase in antibody titre after a booster injection. The same effect was observed with mice primed with antigen and boosted with anti-Id, although these mice exhibited higher antibody titres. A significant idiotype repertoire is shared by anti-hydatid antibodies produced by different individuals of the same or different species, and anti-Id raised against those antibodies behave as surrogate antigens producing a normal primary and secondary response in animals of different species from that used to isolate the Id.     

流感病毒A单抗杂交瘤细胞的制备及鉴定

目的制备抗A型流感病毒的单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的A型流感金标试纸检测方法。方法将A型流感病毒为完全抗原免疫BALB／c小鼠,得到的脾细胞与SP2／0细胞融合,获得稳定分泌抗流感A单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行鉴定。结果用杂交瘤技术,得到了3株可稳定分泌抗流感A单抗的杂交瘤细胞株,能分泌高滴度的针对A型流感病毒的特异单抗。结论本研究建立了抗A型流感病毒杂交瘤细胞株单克隆抗体,为金标法快速诊断A型流感感染打下了试验基础。     

嗜人按蚊中肠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 制备并鉴定抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法 用嗜人按蚊中肠做抗原，用细胞融合技术制备单克隆抗体，并采用ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果 建立了1株持续分泌抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。BALB／c小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1：12800；单克隆抗体的重链属IgG1亚类；Western blot证实单抗能与嗜人按蚊中肠抗原特异性结合。结论 成功制备了抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体。     

细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建

目的分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗。方法分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列。先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95。再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95。电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌。结果双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因Eg95序列和Ag85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功。结论构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的 采用扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)的合成多肽为免疫原制备鼠源单克隆抗体,并用4种埃博拉流行株核蛋白基因的真核表达蛋白对制备的单克隆抗体进行特异性分析。方法 用人工合成的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白多肽免疫动物,进行细胞融合后筛选阳性杂交瘤细胞。构建埃博拉病毒4种亚型的真核表达载体转染HEK293T细胞以表达目的蛋白,再以真核表达蛋白为抗原,用免疫印迹方法分析扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的特异性。结果 完成了抗扎伊尔型单克隆抗体的制备,共得到能分泌抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞12株,小鼠腹水抗体效价介于1∶10⁴~1∶10⁵,其中3株杂交瘤细胞株分泌的抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体与其他3种亚型无交叉反应,抗体效价高、特异性好。结论 成功制备抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体,为建立快速检测埃博拉病毒的方法奠定基础。     

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

抗博尔纳病病毒磷蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的以重组的博尔纳病病毒(BDV)磷蛋白(p24)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法以纯化后的重组BDVp24免疫小鼠,将骨髓瘤细胞与其脾细胞进行融合,经ELISA法筛选出分泌抗p24单抗的细胞株,并对其进行克隆与亚克隆培养,将最终获得的其中2株细胞株分别注入小鼠腹腔制备单抗,经亲和纯化法纯化后,采用ELISA法测定效价,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光鉴定其特异性。结果建立了2株稳定分泌抗p24单抗的杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgG1型。纯化后的腹水抗p24单抗纯度为98%和93%,ELISA效价在1∶81 000以上,该抗体均能识别重组p24蛋白和BDV感染人类少突胶质细胞(Oligodendroglia cell,OL细胞)所表达的p24蛋白。结论成功制备了灵敏性高、特异性好的抗BDVp24单抗,为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据。